作者FireHell (冥煌 = 好硬)
看板Biotech
标题Re: [求救] MTT assay 处理组数值高於控制组
时间Thu Dec 29 21:11:44 2011
※ 引述《unwell ( )》之铭言：
: 已经爬过文了没看过有人问
: 请教板友
: 我做的试验是在caco-2贴附後 加入某药品进行攻毒
: 另外添加两个菌数的某菌
: 想看该菌可否使药品对caco-2的伤害降低
: 结果
: control是没加药品也没加菌 OD值平均视为100%
: 只加药品组OD值是控制组的80% (嗯 还OK)
: 重点来了
: 只加低菌数某菌组OD值居然是control的200%!!
: 我想说 会不会是caco-2跟菌之间有吸附的关系 所以测MTT时也同时测到菌了
: 但在只加高菌数某菌组OD值是control的120%
: 而在药品与菌共同treat下则都低於100%
: 呜哇我该如何解释
: MTT assay结果 实验组比control还高呢?
: 甚至达到200%???
: 补充
: 1. 96-well 细胞数: 2x10^4/well 100 μl/well
: 2. 因为有菌的处理 反应时间设定只有12h
: 3. 在加入MTT之前 有用200 μl PBS wash 2次
: 4. triplicate, standard error挺小的
: 谢谢各位了~~~
: ※ 编辑: unwell 来自: 140.112.154.104 (12/29 17:17)
: 推 FireHell:加入MTT之前不可以用PBS wash，会把酵素洗掉 12/29 17:47
: → FireHell:很多人会犯这个错误 12/29 17:47
: → unwell:MTT是加在medium里处理细胞反应4h 不是测那4h产的酵素? 12/29 18:25
3-4 h是MTT跟succinate dehydrogenase完全反应所需的时间，
不是为了让细胞产生酵素的时间。
当然这段时间细胞也会产酵素，但量少。
: → unwell:如果会洗掉酵素 那吸掉medium那步时不就也吸掉酵素了??? 12/29 18:29
: → unwell:谢谢大家的回应 12/29 18:29
: 推 icome:要测的dehydrogenase在mitochondria 不会被洗掉 12/29 18:40
不多说看paper吧(可惜是残体的)：
http://wenku.baidu.com/view/b290102fed630b1c59eeb578.html?from=related
缓慢吸掉的medium与medium对照组无显着差异，所以不会吸掉很多酵素。
但是PBS洗一次吸光值降低80%；洗两次降低98%。
再不相信就自己实验看看有洗跟没洗的差异吧，
我自己就试过了，吸光值会差非常的多！
如果吸光值太低，即使都是跟control比，data仍会有很大的系统误差。
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.112.218.89
1F：推 aceliang:我实在看不太懂这篇文章...就表11而言，将样品混匀是要？ 12/29 22:09
2F：→ aceliang:既然细胞表面的SDH被洗起，那为什麽上清液组没有formazan 12/29 22:10
3F：→ aceliang:又如果细胞表面沾满了SDH，那MTT本身的意义势必得打折了 12/29 22:11
4F：→ aceliang:大概是我慧根不足吧XDDD 12/29 22:12
5F：→ FireHell:跟楼上有过一样的疑问，这篇很多地方说的不清楚 12/29 22:38
6F：→ FireHell:所以我就自己去试了，有洗两次比都没洗的吸光值下降了0.4 12/29 22:40
7F：→ FireHell:原因的部份我也是对作者的推论存疑 12/29 22:46
8F：→ a001ou:你提供的文献反而表示要洗两次 如此可有效降低培养基中 12/29 22:53
9F：→ a001ou:SDH的量 12/29 22:55
10F：→ FireHell:楼上您看的跟我看的是同一篇吗？ orz 12/29 23:01
11F：→ a001ou:楼上要不要先了解MTT原理再来? MTT是测细胞"内"粒线体呼吸 12/29 23:30
12F：→ a001ou:链活性 今天你说wash会导致MTT结果减弱 那表示包外充满会 12/29 23:31
13F：→ a001ou:造成MTT形成紫色结晶的物质(不论是酵素还是化学物质) 那就 12/29 23:32
14F：→ a001ou:表示若不wash 那MTT结晶几乎都是包外物质造成的 如此将严重 12/29 23:33
15F：→ a001ou:影响MTT所要观察的粒线体活性 why？因为wash不会洗到胞"内" 12/29 23:35
16F：→ a001ou:的粒线体 12/29 23:35
楼上讲话很呛喔，MTT原理我还要你教？
你有看到paper的结论5吗？所以三位作者都不懂MTT原理呢！introduction写假的？
你要不要先了解MTT的目的再来？主要是测prolifiration耶！
哪篇教科书限定胞内粒线体上的SDH才能是指标，其它也是细胞分泌的就不算？
可以麻烦您找给我吗？
你可以多去打听其它实验室或其它学校怎麽做，加MTT前不wash的一堆好吗？
17F：推 icome:可能是细胞凋亡释放出来的 找不到SDH会被释放的文献 12/30 00:19
18F：→ blence:MTT不只用来测proliferation,NADH-NAD pool测量也能用 12/30 00:44
19F：→ soom:请板友讨论时避免情绪性言词 12/30 09:44
20F：推 unwell:谢谢原PO的回应 但是我wash了两次 是为了把菌尽量wash乾净 12/30 11:41
21F：推 unwell:而且即使wash了两次最後OD值都很高 甚至扣掉blank後还 >1 12/30 11:47
22F：→ unwell:>1会不呈线性 我会再调整 不过我还是想问 有没有可能这个菌 12/30 11:48
23F：→ unwell:会刺激粒线体里酵素的表现 如果是 那其他做药物处理测MTT的 12/30 11:50
24F：→ unwell:试验不就都可能得考虑会不会刺激酵素的表现而结果误差很大 12/30 11:51
25F：→ FireHell:回楼上原原PO，OD值高是因为您种的浓，如果真的有wash必 12/30 13:15
26F：→ FireHell:要，您又考量SDH遭受菌或药物影响，可以考虑改用PI stain 12/30 13:16
27F：→ FireHell:作为您测存活率的方法 12/30 13:16
28F：→ FireHell:MTT assay作为viability确实有其前提，像饥饿(serum free 12/30 13:28
29F：→ FireHell:的环境下就可能会因autophagy降低SDH的量，值得注意 12/30 13:29
30F：→ FireHell:又比如说在complete medium环境下以autophagy inhibitor 12/30 15:46
31F：→ FireHell:(3-MA, CQ) treat细胞，会得到>100%的结果 12/30 15:47
32F：→ a001ou:那你要不要解释一下你的推文 什麽叫做很多人犯的错误 加 12/31 00:11
33F：→ a001ou:MTT前不该wash？ 完全是误导别人 还怪别人呛? 12/31 00:11
34F：→ a001ou:有多少protocol跟原理说明wash不影响MTT 你却任意引用一篇 12/31 00:12
35F：→ a001ou:说得不清不楚的文献却用肯定的语气来支持这充满问题的结果 12/31 00:13
36F：→ a001ou:你真的觉得这样误导别人是正确的? 12/31 00:14
37F：→ a001ou:还是说你有很好得证据支持你说wash"可以"有效抑制粒线体活 12/31 00:16
38F：→ a001ou:性 导致MTT结果失准? 毫无证据的乱说 我这态度刚好而已 12/31 00:17
结果你还是没有提供任何的文献、亲手做任何的实验
而以上这两件事我都做了，我也不知道该说什麽了 =.=
39F：推 martyrtitan:楼上 原PO不就有尝试过了? 12/31 00:59
40F：→ martyrtitan:版主都说避免情绪用词了 这麽呛有必要嘛 12/31 01:00
※ 编辑: FireHell 来自: 140.112.218.89 (01/01 23:54)