作者hank578 (豪)
看板Biotech
標題[求救] 以BL21 pET29a 方式表現蛋白
時間Tue Dec 20 20:00:48 2011
第一次發文 請見諒
我是想要用pET29a insert 一段我想要表現的protein
pET29a 利用EcoRI, NotI 來切割
PCR product 同樣
DNA(plasmid) 1ug
RE10xbuffer 2ul
BSA 0.2ul
EcoRI,NotI 0.5ul*2
sH2O to 20ul 37度 2hr 65度 15mins inactivation
pET29a 及PCR product 以RE切完 跑膠純化
以Nanodrop 測濃度 大約已pET29a:PCR=1:5 比例去做ligation overnight
接著加入 BL21 competent cell 約 5ul
冰上30mins
42度 heat shock
+SOC 1hr
塗在LB plate 含Kana (40ug/ml)
長出的菌我以 T7primer 去做colony PCR 都無法夾到
我是有推測出幾個問題
plasmid我以T7primer 去夾是OK的
沒有insert時回夾出300bp的大小
我ligation的plasmid都是7~800bp (表示insert是成功的)
BL21 competent cell 是我自己做的 (第一次做, 且實驗室沒人做過)
我一開始推測我的competent cell有問題
所以後來我有去用我們家買的commercial 的DH5alpha 將我做的plasmid送入
竟然沒長!
我會想要做這個方式是因為畢業的學長做過，但是聽說他是因為plasmid有問題
他也是try很久才做出來，我現在很confuse
plasmid用T7primer去夾 應該是是正確的
但是用兩種competent cell 都無法正常的transformation
有好心人可以指點嗎 卡一陣子了 很需要這個data= =
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.120.209.85
1F：推 leoblack:我以為ligation完後會先送到DH5alpha先amplify才送BL21 12/20 21:13
2F：推 conective:你應該先確認ligation完東西的正確性 如果直接切pcr 12/20 21:39
3F：→ conective:product一直不行 可試試看先作TA cloning 12/20 21:40
4F：推 conective:另外切膠回收後NANODROP測的濃度是多少？最好跑膠看一下 12/20 21:43
5F：→ conective:NANODROP在低濃度時有時會高估濃度 造成ligation有問題 12/20 21:44
6F：推 dodomilk:我ligation的plasmid都是7~800bp <= 不懂 12/20 21:44
7F：→ conective:DH-5α沒長的話代表你原本ligation產物可能就有問題 12/20 21:45
8F：→ dodomilk:但我猜你的restriction enzyme切不動pcr product 12/20 21:45
9F：→ conective:要回歸基本面檢查切位跟PCR產物上的切位 不然再怎麼作 12/20 21:45
10F：→ conective:都一樣 而不是勝任細胞的問題 你隨便拿個正常plasmid 12/20 21:46
11F：→ dodomilk:建議同三樓，先作TA cloning再切，至少能確定有切下來 12/20 21:46
12F：→ conective:去transformation(濃度ng級) 如果正常長代表勝任細胞沒 12/20 21:46
13F：→ conective:問題 一個一個排除 但因為前人經驗plasmid有問題所以 12/20 21:47
14F：→ conective:你應該先懷疑plasmid跟PCR產物 如果可以還是定序 12/20 21:48
15F：推 leoblack:你的PCR產物切位是在端點嘛?!如果是~你恐怕要考慮這個網 12/20 22:44
18F：→ hank578:好心人們可以站內信給我你們MSN嗎 直接問 12/20 23:29
19F：→ lyu0001:要做positive and negative control。 12/20 23:58