作者hank578 (豪)
看板Biotech
标题[求救] 以BL21 pET29a 方式表现蛋白
时间Tue Dec 20 20:00:48 2011
第一次发文 请见谅
我是想要用pET29a insert 一段我想要表现的protein
pET29a 利用EcoRI, NotI 来切割
PCR product 同样
DNA(plasmid) 1ug
RE10xbuffer 2ul
BSA 0.2ul
EcoRI,NotI 0.5ul*2
sH2O to 20ul 37度 2hr 65度 15mins inactivation
pET29a 及PCR product 以RE切完 跑胶纯化
以Nanodrop 测浓度 大约已pET29a:PCR=1:5 比例去做ligation overnight
接着加入 BL21 competent cell 约 5ul
冰上30mins
42度 heat shock
+SOC 1hr
涂在LB plate 含Kana (40ug/ml)
长出的菌我以 T7primer 去做colony PCR 都无法夹到
我是有推测出几个问题
plasmid我以T7primer 去夹是OK的
没有insert时回夹出300bp的大小
我ligation的plasmid都是7~800bp (表示insert是成功的)
BL21 competent cell 是我自己做的 (第一次做, 且实验室没人做过)
我一开始推测我的competent cell有问题
所以後来我有去用我们家买的commercial 的DH5alpha 将我做的plasmid送入
竟然没长!
我会想要做这个方式是因为毕业的学长做过，但是听说他是因为plasmid有问题
他也是try很久才做出来，我现在很confuse
plasmid用T7primer去夹 应该是是正确的
但是用两种competent cell 都无法正常的transformation
有好心人可以指点吗 卡一阵子了 很需要这个data= =
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.120.209.85
1F：推 leoblack:我以为ligation完後会先送到DH5alpha先amplify才送BL21 12/20 21:13
2F：推 conective:你应该先确认ligation完东西的正确性 如果直接切pcr 12/20 21:39
3F：→ conective:product一直不行 可试试看先作TA cloning 12/20 21:40
4F：推 conective:另外切胶回收後NANODROP测的浓度是多少？最好跑胶看一下 12/20 21:43
5F：→ conective:NANODROP在低浓度时有时会高估浓度 造成ligation有问题 12/20 21:44
6F：推 dodomilk:我ligation的plasmid都是7~800bp <= 不懂 12/20 21:44
7F：→ conective:DH-5α没长的话代表你原本ligation产物可能就有问题 12/20 21:45
8F：→ dodomilk:但我猜你的restriction enzyme切不动pcr product 12/20 21:45
9F：→ conective:要回归基本面检查切位跟PCR产物上的切位 不然再怎麽作 12/20 21:45
10F：→ conective:都一样 而不是胜任细胞的问题 你随便拿个正常plasmid 12/20 21:46
11F：→ dodomilk:建议同三楼，先作TA cloning再切，至少能确定有切下来 12/20 21:46
12F：→ conective:去transformation(浓度ng级) 如果正常长代表胜任细胞没 12/20 21:46
13F：→ conective:问题 一个一个排除 但因为前人经验plasmid有问题所以 12/20 21:47
14F：→ conective:你应该先怀疑plasmid跟PCR产物 如果可以还是定序 12/20 21:48
15F：推 leoblack:你的PCR产物切位是在端点嘛?!如果是~你恐怕要考虑这个网 12/20 22:44
18F：→ hank578:好心人们可以站内信给我你们MSN吗 直接问 12/20 23:29
19F：→ lyu0001:要做positive and negative control。 12/20 23:58