作者martyrtitan (Martyrs)
看板Biotech
標題[求救] Western transfer
時間Mon Dec 19 00:56:56 2011
又是一個transfer的困擾了
我要看的是Microtubule associated protrein (MAP1B, MAP2)
這兩個蛋白質的MW大致為270 kDa左右
20% methnol 0% SDS 的transfer buffer (有預冷)
濕式 (hoefer 8*9cm^2) 450mA 2.5hr 和 3hr
膠體都有殘留 但我確定沒過頭(我墊兩張PVDF)
這次改用爬文的buffer條件
10% methnol 0.05% SDS (有預冷)
450mA 2.5hr
transfer的時候泡泡超多
transfer完我染膠和膜 兩個都沒有....(第二層PVDF也沒有)
我確定電極沒插反 (PVDF上有很糊的marker...)
請問各位前輩
是有什麼問題造成的呢？
補充：Total protein 37.5ug
marker 5uL
另外請問一下..能Transfer到一半置換buffer嘛?
想說如果可以..buffer變溫後就換另一瓶冰的buffer (有包冰 也有預冷)
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◆ From: 140.112.98.129
※ 編輯: martyrtitan 來自: 140.112.98.129 (12/19 00:57)
1F：推 FENOR:marker會很糊的話你transfer在設置的時候應該就有問題 12/19 09:22
2F：→ FENOR:和protein大小無關 12/19 09:22
3F：→ FENOR:270kDa的話要不要試試semidry? 12/19 09:23
4F：→ martyrtitan:我們家只有濕式的 12/19 10:07
5F：→ martyrtitan:之前用20% Methnol和SDS-free的buffer, marker很清楚 12/19 10:08
6F：→ martyrtitan:這次我跑兩張 一張marker不見了 一張很糊 12/19 10:09
※ 編輯: martyrtitan 來自: 140.112.4.195 (12/19 10:10)
7F：→ spears135:糊糊的話也有可能是過熱 放4度....... 12/19 10:15
這倒是有可能....
8F：推 czyangshoo:也有可能是沒夾緊 12/19 17:50
有夾緊
9F：推 leoblack:大kDa蛋白用wet比較好吧= ="~怎麼不試試100mA o/n?! 12/19 23:34
忘記所上有一間Cool room....
10F：推 lyu0001:PVDF是有先浸潤過100％methanol or 95%ethanol for 5min? 12/20 11:32
有低
※ 編輯: martyrtitan 來自: 140.112.98.129 (12/20 12:57)
11F：推 lyu0001:該不會是PVDF有問題？ 12/20 13:41
12F：→ lyu0001:我用400mA 1hr，就可以把170kDa轉過去。 12/20 13:46
13F：推 bluecsky:連marker都湖就是條件有問題了,大Kda是會比較難轉過去 12/20 14:25
14F：→ bluecsky:但是不可能會影響到你的marker,重新確認一次所有的條件 12/20 14:25
15F：→ bluecsky:然後放冷房或冰箱跑,可以的話就用o/n的條件跑會更好 12/20 14:26
16F：→ bluecsky:至於電流開多大就看你tank多大,然後去查一下就知道了 12/20 14:26
17F：推 luhs:可能過熱的成分比較多 01/12 15:52