作者martyrtitan (Martyrs)
看板Biotech
标题[求救] Western transfer
时间Mon Dec 19 00:56:56 2011
又是一个transfer的困扰了
我要看的是Microtubule associated protrein (MAP1B, MAP2)
这两个蛋白质的MW大致为270 kDa左右
20% methnol 0% SDS 的transfer buffer (有预冷)
湿式 (hoefer 8*9cm^2) 450mA 2.5hr 和 3hr
胶体都有残留 但我确定没过头(我垫两张PVDF)
这次改用爬文的buffer条件
10% methnol 0.05% SDS (有预冷)
450mA 2.5hr
transfer的时候泡泡超多
transfer完我染胶和膜 两个都没有....(第二层PVDF也没有)
我确定电极没插反 (PVDF上有很糊的marker...)
请问各位前辈
是有什麽问题造成的呢？
补充：Total protein 37.5ug
marker 5uL
另外请问一下..能Transfer到一半置换buffer嘛?
想说如果可以..buffer变温後就换另一瓶冰的buffer (有包冰 也有预冷)
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◆ From: 140.112.98.129
※ 编辑: martyrtitan 来自: 140.112.98.129 (12/19 00:57)
1F：推 FENOR:marker会很糊的话你transfer在设置的时候应该就有问题 12/19 09:22
2F：→ FENOR:和protein大小无关 12/19 09:22
3F：→ FENOR:270kDa的话要不要试试semidry? 12/19 09:23
4F：→ martyrtitan:我们家只有湿式的 12/19 10:07
5F：→ martyrtitan:之前用20% Methnol和SDS-free的buffer, marker很清楚 12/19 10:08
6F：→ martyrtitan:这次我跑两张 一张marker不见了 一张很糊 12/19 10:09
※ 编辑: martyrtitan 来自: 140.112.4.195 (12/19 10:10)
7F：→ spears135:糊糊的话也有可能是过热 放4度....... 12/19 10:15
这倒是有可能....
8F：推 czyangshoo:也有可能是没夹紧 12/19 17:50
有夹紧
9F：推 leoblack:大kDa蛋白用wet比较好吧= ="~怎麽不试试100mA o/n?! 12/19 23:34
忘记所上有一间Cool room....
10F：推 lyu0001:PVDF是有先浸润过100％methanol or 95%ethanol for 5min? 12/20 11:32
有低
※ 编辑: martyrtitan 来自: 140.112.98.129 (12/20 12:57)
11F：推 lyu0001:该不会是PVDF有问题？ 12/20 13:41
12F：→ lyu0001:我用400mA 1hr，就可以把170kDa转过去。 12/20 13:46
13F：推 bluecsky:连marker都湖就是条件有问题了,大Kda是会比较难转过去 12/20 14:25
14F：→ bluecsky:但是不可能会影响到你的marker,重新确认一次所有的条件 12/20 14:25
15F：→ bluecsky:然後放冷房或冰箱跑,可以的话就用o/n的条件跑会更好 12/20 14:26
16F：→ bluecsky:至於电流开多大就看你tank多大,然後去查一下就知道了 12/20 14:26
17F：推 luhs:可能过热的成分比较多 01/12 15:52