發問時請注意，若是要問實驗相關的問題，請將實驗的步驟、所用的條件大致列出 以方便板友幫您追蹤問題 ----請將上列注意事項以 ctrl + k 刪除後開始編輯文章---- 板上各位前輩大家晚安~~~ 小弟最近在作site-directed mutagenesis 但是一直遇到個問題.... 跑完PCR後 會用Dpn 1在37度下切個一小時 然後跑Agarose Gel 確認一下大小~ 跑出來的結果在預期的地方(6K)看不到band?? 但是在1K那卻有Band?? 這..到底是發生了什麼事?? 是PCR沒有作到我要放大的基因嗎?? 還是primer亂黏?? 這樣我還需要transformation到DH-5 alpha嗎?? (感覺作了也長不出colony....~"~) (小弟用的vector是pET30(約6K左右)；promoter是T7 promoter) 附上小弟的PCR的材料... 5uL 10xpfu buffer 1uL Primer Forward 1uL Primer Reverse 5uL dNTP(因為放-20度C有點時間了~所以想說多加一點) 15uL Plasmid(因為濃度有點低~所以才多放一點@@) 22uL dd-water(滅過菌的) 1uL pfu polymerase ------------------------------------------------------ Total 50uL PCR的condition如下.... 95度C Pre-heating 95度C 30秒 55度C 1分鐘 68度C 10分鐘(看protocol是寫1kb/mins) 共12cycle~ 不知道板上的前輩們能不能給晚輩我一點建議... 或是有哪個步驟作錯了 (少加什麼?或不該加什麼?) 懇請給予小弟指導~~ 拜託大家了 > < 謝謝~~~~~~ --

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