发问时请注意，若是要问实验相关的问题，请将实验的步骤、所用的条件大致列出 以方便板友帮您追踪问题 ----请将上列注意事项以 ctrl + k 删除後开始编辑文章---- 板上各位前辈大家晚安~~~ 小弟最近在作site-directed mutagenesis 但是一直遇到个问题.... 跑完PCR後 会用Dpn 1在37度下切个一小时 然後跑Agarose Gel 确认一下大小~ 跑出来的结果在预期的地方(6K)看不到band?? 但是在1K那却有Band?? 这..到底是发生了什麽事?? 是PCR没有作到我要放大的基因吗?? 还是primer乱黏?? 这样我还需要transformation到DH-5 alpha吗?? (感觉作了也长不出colony....~"~) (小弟用的vector是pET30(约6K左右)；promoter是T7 promoter) 附上小弟的PCR的材料... 5uL 10xpfu buffer 1uL Primer Forward 1uL Primer Reverse 5uL dNTP(因为放-20度C有点时间了~所以想说多加一点) 15uL Plasmid(因为浓度有点低~所以才多放一点@@) 22uL dd-water(灭过菌的) 1uL pfu polymerase ------------------------------------------------------ Total 50uL PCR的condition如下.... 95度C Pre-heating 95度C 30秒 55度C 1分钟 68度C 10分钟(看protocol是写1kb/mins) 共12cycle~ 不知道板上的前辈们能不能给晚辈我一点建议... 或是有哪个步骤作错了 (少加什麽?或不该加什麽?) 恳请给予小弟指导~~ 拜托大家了 > < 谢谢~~~~~~ --

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