我一直有個問題困擾我很久了 我的實驗主要是取大鼠substantia nigra(SN,黑質核)區來跑Western 用的lysis buffer是自己配的 配方如下 1. 10% glyceral 2. 1% tritone X-100 3. 1% protinase inhibitor 4. 88% PBS 我的步驟是 每一個SN會先加入適量的lysis buffer 再到均質機用超音波將組織震碎 震碎的過程都是on ice(避免過熱 破壞Sample) 離心條件是 4度C 21380 rcf 10min 常常在離心完後 我的tisssue就分三層 最下層為pellet 中間層 也就是最多的一層 常常都是濁濁黃黃的 最上層 透明澄清 但是每次都很少 有的時候根本就跟中間層混在一起 我想問的問題如下 1. 理論上在離心完後應該是只會有兩層 一層是pellet 另一層就是澄清的上清液 我會有濁濁黃黃那層 是不是lysis buffer的問題? 濁濁黃黃的那層是不是DNA的碎片或其他雜質? 若將他抽出來一起做PROTEIN定量 跑出來的actin是否會容易不準呢? 2. 我有查過一些PAPER 取SN的組織跑WB PAPER上用的配方和我們家自己配的有很大的差異 所以想請問版上的各位 不知道有沒有人有跑過SN的WB 可否分享您使用的lysis buffer 配方? 3. 加入Lysis buffer時 各位覺得要秤重再依照重量加入一定比例體積的lysis buffer 較好 還是每一管Sample都加入固定量的lysis buffer較好? 問題跟敘述有點多 還請各位高手耐心看完 先在這邊感謝大家的建議^^" --

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