我一直有个问题困扰我很久了 我的实验主要是取大鼠substantia nigra(SN,黑质核)区来跑Western 用的lysis buffer是自己配的 配方如下 1. 10% glyceral 2. 1% tritone X-100 3. 1% protinase inhibitor 4. 88% PBS 我的步骤是 每一个SN会先加入适量的lysis buffer 再到均质机用超音波将组织震碎 震碎的过程都是on ice(避免过热 破坏Sample) 离心条件是 4度C 21380 rcf 10min 常常在离心完後 我的tisssue就分三层 最下层为pellet 中间层 也就是最多的一层 常常都是浊浊黄黄的 最上层 透明澄清 但是每次都很少 有的时候根本就跟中间层混在一起 我想问的问题如下 1. 理论上在离心完後应该是只会有两层 一层是pellet 另一层就是澄清的上清液 我会有浊浊黄黄那层 是不是lysis buffer的问题? 浊浊黄黄的那层是不是DNA的碎片或其他杂质? 若将他抽出来一起做PROTEIN定量 跑出来的actin是否会容易不准呢? 2. 我有查过一些PAPER 取SN的组织跑WB PAPER上用的配方和我们家自己配的有很大的差异 所以想请问版上的各位 不知道有没有人有跑过SN的WB 可否分享您使用的lysis buffer 配方? 3. 加入Lysis buffer时 各位觉得要秤重再依照重量加入一定比例体积的lysis buffer 较好 还是每一管Sample都加入固定量的lysis buffer较好? 问题跟叙述有点多 还请各位高手耐心看完 先在这边感谢大家的建议^^" --

※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc) ◆ From: 120.126.66.117