作者bigtuna (深海大鯊魚)
看板Biotech
標題[求救] HUVEC抽RNA
時間Sun Dec 11 23:39:25 2011
各位版友好
每次做HUVEC時都看不到沉澱，這樣算正常嗎?我是6well(2.5X10^5養一天)
然後這次抽RNA時覺得怪怪的，定量時RNA濃度不夠
希望專家可以幫我解惑，或步驟可以改善的，謝謝^___^
下面是抽RNA的步驟
(抽RNA)
1.加Tri reagent 500 uL
2.用刮勺刮下細胞
3.收至eppendorff，室溫靜置5 min
4.加chloroform 100 uL，vortex vigorously 25-30s, 4度C靜置5 min
5.離心: 12000g, 4度C, 15 min
6.吸上清液220 uL至新eppendorff
7.加Isopropanol 220 uL, vortex mildly 25-30s, 4度C靜置5 min
8.離心: 12000g, 4度C, 10 min
9.倒掉上清液，加500 uL 75% EtOH, 輕微搖eppendorff數次
10.離心: 7500g, 4度C, 5 min
11.重複9, 10步驟一次
12.移至hood airdry 15-20 min
13.加DEPC-H2O 5 uL回溶
14.定量RNA濃度
想請問一下是不是第十步離心轉速的問題(要調至12000g?)
去網路找protocol和自己實驗室的步驟有一些差別
之前做HUVEC的學長畢業了
想問一下大家的看法，感激不盡
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 61.220.23.42
1F：→ huuban:請問樣本量、比值、濃度、膠圖？ 12/12 14:15
2F：→ huuban:第十步應該可以調至最高轉速 12/12 14:15
3F：→ huuban:確定有完全溶出嗎？ 12/12 14:16
huuban大你好
Sample量以5 uL回溶最多在500 ng/uL左右(之前測的)
細胞量大概是在八九分滿就會開始做了(Starve 8小時)
因為之前做都看不到沉澱，我會在定量RNA時用tip來回攪拌,讓它均勻(輕微，沒有排空氣)
所以轉速應該不會影響到RNA sample吧(之前很納悶為什麼看到的protocol都是7500g的)
如果不影響的話 那小弟就先試試看了 謝謝你Orz
※ 編輯: bigtuna 來自: 120.126.85.122 (12/12 22:42)
4F：→ huuban:這個嘛，我沒有抽過細胞，你給的條件不好找出問題在哪裡 12/13 13:49
5F：→ huuban:在酒精沉澱如果轉速低有可能RNA沒有全部下來吧 12/13 13:51
6F：→ huuban:不過假使你每次操作方式都一樣，那這次問題不是出在這裡 12/13 13:51
7F：→ huuban:也可能是input量就少所以抽出來就少？ 12/13 13:53
8F：→ bigtuna:恩恩 謝謝你 我知道該怎麼做了^^ 12/14 02:02
9F：推 supray:第7步可加glycogen然後放-20度C半小時以上幫助沉澱 12/15 09:36
10F：→ bigtuna:謝謝^^ 12/17 23:08