作者bigtuna (深海大鲨鱼)
看板Biotech
标题[求救] HUVEC抽RNA
时间Sun Dec 11 23:39:25 2011
各位版友好
每次做HUVEC时都看不到沉淀，这样算正常吗?我是6well(2.5X10^5养一天)
然後这次抽RNA时觉得怪怪的，定量时RNA浓度不够
希望专家可以帮我解惑，或步骤可以改善的，谢谢^___^
下面是抽RNA的步骤
(抽RNA)
1.加Tri reagent 500 uL
2.用刮勺刮下细胞
3.收至eppendorff，室温静置5 min
4.加chloroform 100 uL，vortex vigorously 25-30s, 4度C静置5 min
5.离心: 12000g, 4度C, 15 min
6.吸上清液220 uL至新eppendorff
7.加Isopropanol 220 uL, vortex mildly 25-30s, 4度C静置5 min
8.离心: 12000g, 4度C, 10 min
9.倒掉上清液，加500 uL 75% EtOH, 轻微摇eppendorff数次
10.离心: 7500g, 4度C, 5 min
11.重复9, 10步骤一次
12.移至hood airdry 15-20 min
13.加DEPC-H2O 5 uL回溶
14.定量RNA浓度
想请问一下是不是第十步离心转速的问题(要调至12000g?)
去网路找protocol和自己实验室的步骤有一些差别
之前做HUVEC的学长毕业了
想问一下大家的看法，感激不尽
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 61.220.23.42
1F：→ huuban:请问样本量、比值、浓度、胶图？ 12/12 14:15
2F：→ huuban:第十步应该可以调至最高转速 12/12 14:15
3F：→ huuban:确定有完全溶出吗？ 12/12 14:16
huuban大你好
Sample量以5 uL回溶最多在500 ng/uL左右(之前测的)
细胞量大概是在八九分满就会开始做了(Starve 8小时)
因为之前做都看不到沉淀，我会在定量RNA时用tip来回搅拌,让它均匀(轻微，没有排空气)
所以转速应该不会影响到RNA sample吧(之前很纳闷为什麽看到的protocol都是7500g的)
如果不影响的话 那小弟就先试试看了 谢谢你Orz
※ 编辑: bigtuna 来自: 120.126.85.122 (12/12 22:42)
4F：→ huuban:这个嘛，我没有抽过细胞，你给的条件不好找出问题在哪里 12/13 13:49
5F：→ huuban:在酒精沉淀如果转速低有可能RNA没有全部下来吧 12/13 13:51
6F：→ huuban:不过假使你每次操作方式都一样，那这次问题不是出在这里 12/13 13:51
7F：→ huuban:也可能是input量就少所以抽出来就少？ 12/13 13:53
8F：→ bigtuna:恩恩 谢谢你 我知道该怎麽做了^^ 12/14 02:02
9F：推 supray:第7步可加glycogen然後放-20度C半小时以上帮助沉淀 12/15 09:36
10F：→ bigtuna:谢谢^^ 12/17 23:08