作者lier1986 (紫)
看板Biotech
標題[求救] cloning已經做了5個月...
時間Mon Nov 14 15:07:42 2011
我一共有四個gene要clone
用的plasmid是pET20b
RE site用 NdeI 跟 XhoI
在primer設計上 已經把RE site加進去 且在RE site前面多加兩個G
但一直沒辦法把insert接進去
後來改用TA cloning(但最後還是要把gene放到pET20b裡...)
將PCR product clean up後
直接用基龍米克斯的TA cloning kit
將PCR product跟TA vector進行ligation
transformation後 做藍白篩
有clone到其中一個gene
但 藍白篩的偽陽性很高 我挑六顆白色的菌 卻只有一個有我要的insert
其它都只有TA vector
另外 我想問
自製的competent cell 要怎樣做才堪用阿?
我做了兩三次的competent cell 但是前兩次的都不能用
transform完跟本不會長菌
第三次做的competent cell時長時不長...
還有 到底怎樣做cloning成功的機會比較高阿?
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.122.199.39
1F：→ blence:NdeI只多兩個bp恐怕不夠 11/14 16:14
2F：→ f9361046:你有測試一下competent cell的效率嗎? 11/14 16:27
3F：→ lier1986:可是我學長他用NdeI也是多兩個G就可以做得出來@@ 11/14 16:32
4F：→ lier1986:competent cell 就是有用過positive control 也不會長 11/14 16:33
5F：→ lier1986:我老闆是說 自製的competent cell 過程要快 11/14 16:34
6F：→ lier1986:但光是分裝就要分幾十管 怎麼快得起來... 11/14 16:35
7F：推 HEK293:真的不夠快，就去冷房做。 11/14 18:17
8F：→ HEK293:competent cell的buffer可能要檢查一下，是用CaCl2? 11/14 18:17
9F：→ lier1986:我們lab是用電穿孔 所以製作competent cell的buf.沒有用 11/14 18:35
10F：→ lier1986:沒有用CaCl2 是直接用10%的甘油 11/14 18:36
11F：推 icome:competent celll沒有那麼難做 你可能需要更換可靠的protocol 11/14 20:13
12F：推 owl628:同意樓上,以前一次常常做50管以上都沒甚麼問題 11/14 21:20
13F：推 f9361046:我也覺得很好做.... 11/14 22:48
14F：→ f9361046:我也是用10%甘油的... 11/14 22:50
15F：推 dodomilk:restriction enzyme有時候真的很難講... 11/14 23:08
16F：→ dodomilk:明明加的東西、切的東西都一樣，不同次作效果就是會不同 11/14 23:09
17F：→ dodomilk:我覺得接到TA clone之後再切比較保險 11/14 23:10
18F：→ dodomilk:另外藍白篩的時候，可以把plate放進4度冰箱 11/14 23:10
19F：→ dodomilk:過一陣子你說的偽陽性colonies就會變成藍色了 11/14 23:11
20F：→ NKTcell:RE site多的bp有點少耶 11/15 00:42
21F：推 bluecsky:我不知道你一管裝多少 以前lab做都是上百管一次做的 11/15 07:24
22F：→ bluecsky:所以速度不是最大問題 我倒覺得問題可能出在前面的步驟 11/15 07:25
23F：→ bluecsky:或者更可能最原始拿到的sotck菌已經有問題了 所以一路錯 11/15 07:25
24F：→ bluecsky:另外電穿孔的機器條件設定你有確認正確嗎?弄錯也是掛歐 11/15 07:26
25F：→ lier1986:更可靠的competent cell protocol有人可以提供嗎? 11/15 12:24
26F：→ lier1986:我現在就是在用TA clone 但是成功率還是很低... 11/15 12:25
27F：→ lier1986:我是有發現放四度C有些白的菌落會變藍色 但大概要放多久 11/15 12:25
28F：→ lier1986:我知道RE site前多的bp確實是有點少 11/15 12:27
29F：→ lier1986:但多了幾個bp就真的做得出來嗎...? 11/15 12:28
30F：→ lier1986:stock菌是學長給我的 品系是XL1-blue有什麼方式可以確認 11/15 12:31
31F：→ lier1986:stock對或錯嗎? 11/15 12:32
32F：→ lier1986:電穿孔的機器設定上應該是沒問題的 positive control有 11/15 12:33
33F：→ lier1986:長出很多菌 11/15 12:33
34F：→ lier1986:感謝各位提供的意見 11/15 12:42
35F：→ shenhsu:XL1-blue好像有抗tetracyclin? 可以試一下 11/15 13:09
36F：推 dodomilk:長出很多菌是有多少菌？ 每0.1ng DNA要長出100個colonies 11/15 15:18
37F：→ dodomilk:才能用來作ligation喔！ 11/15 15:18
38F：推 boyo:也許重點在基隆米克斯........... 11/15 21:48
39F：→ GauYi: 台南米格虜 11/15 22:38
40F：→ lier1986:boyo這個id好像有點眼熟...該不會是PTT的那個名人吧@@ 11/16 21:51
41F：→ lier1986:話說 基隆米克斯的東西有什麼問題嗎?? 11/16 21:52
42F：推 bluecsky:他的意思是你的kit可能有問題 可以商界別人家的kit試看看 11/17 10:15
43F：→ bluecsky:一般PCR product做TA clone成功率應該不低才是正常的 11/17 10:16
44F：→ bluecsky:competent cell protocol我都參考molecluar cloning做的 11/17 10:16
45F：→ shenhsu:感覺comptent cell問題比較大.... 11/17 14:38
46F：→ lier1986:competent cell是一個大問題沒錯 我一直摸不著頭緒 11/21 14:03
47F：→ lier1986:到底我做的competent cell是哪邊出了問題 11/21 14:03
48F：→ lier1986:那我現在在參考molecular cloning的方式 正在嘗試 11/21 14:04
49F：→ lier1986:那TA cloning的部分 我之前用的competent cell是學長做的 11/21 14:05
50F：→ lier1986:也確認過他做的competent cell是可以用的 11/21 14:06
51F：→ lier1986:只是效率應該是沒有到0.1 ng DNA 長100 colonies這麼高 11/21 14:09
52F：→ lier1986:但在做ligation & transformation後 還是可以長出菌落 11/21 14:10
53F：→ lier1986:可是 藍白篩中卻有很高的偽陽性 問題到底出在哪...? 11/21 14:11
54F：→ keepseaching:原po在做TA clone時 insert前後有沒有加A阿？ 11/21 22:39
55F：→ keepseaching:還有去除vector的磷酸根可以防止self-ligation 11/21 22:41
56F：→ lier1986:A應該是有加 我是用Taq polymerase 理論上應該是有 11/22 11:58
57F：→ lier1986:vector是買kit的 裡面的plasmid是linear form的 11/22 12:01
58F：→ lier1986:應該也是有用phosphatase處理過的才是... 11/22 12:04