作者lier1986 (紫)
看板Biotech
标题[求救] cloning已经做了5个月...
时间Mon Nov 14 15:07:42 2011
我一共有四个gene要clone
用的plasmid是pET20b
RE site用 NdeI 跟 XhoI
在primer设计上 已经把RE site加进去 且在RE site前面多加两个G
但一直没办法把insert接进去
後来改用TA cloning(但最後还是要把gene放到pET20b里...)
将PCR product clean up後
直接用基龙米克斯的TA cloning kit
将PCR product跟TA vector进行ligation
transformation後 做蓝白筛
有clone到其中一个gene
但 蓝白筛的伪阳性很高 我挑六颗白色的菌 却只有一个有我要的insert
其它都只有TA vector
另外 我想问
自制的competent cell 要怎样做才堪用阿?
我做了两三次的competent cell 但是前两次的都不能用
transform完跟本不会长菌
第三次做的competent cell时长时不长...
还有 到底怎样做cloning成功的机会比较高阿?
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.122.199.39
1F：→ blence:NdeI只多两个bp恐怕不够 11/14 16:14
2F：→ f9361046:你有测试一下competent cell的效率吗? 11/14 16:27
3F：→ lier1986:可是我学长他用NdeI也是多两个G就可以做得出来@@ 11/14 16:32
4F：→ lier1986:competent cell 就是有用过positive control 也不会长 11/14 16:33
5F：→ lier1986:我老板是说 自制的competent cell 过程要快 11/14 16:34
6F：→ lier1986:但光是分装就要分几十管 怎麽快得起来... 11/14 16:35
7F：推 HEK293:真的不够快，就去冷房做。 11/14 18:17
8F：→ HEK293:competent cell的buffer可能要检查一下，是用CaCl2? 11/14 18:17
9F：→ lier1986:我们lab是用电穿孔 所以制作competent cell的buf.没有用 11/14 18:35
10F：→ lier1986:没有用CaCl2 是直接用10%的甘油 11/14 18:36
11F：推 icome:competent celll没有那麽难做 你可能需要更换可靠的protocol 11/14 20:13
12F：推 owl628:同意楼上,以前一次常常做50管以上都没甚麽问题 11/14 21:20
13F：推 f9361046:我也觉得很好做.... 11/14 22:48
14F：→ f9361046:我也是用10%甘油的... 11/14 22:50
15F：推 dodomilk:restriction enzyme有时候真的很难讲... 11/14 23:08
16F：→ dodomilk:明明加的东西、切的东西都一样，不同次作效果就是会不同 11/14 23:09
17F：→ dodomilk:我觉得接到TA clone之後再切比较保险 11/14 23:10
18F：→ dodomilk:另外蓝白筛的时候，可以把plate放进4度冰箱 11/14 23:10
19F：→ dodomilk:过一阵子你说的伪阳性colonies就会变成蓝色了 11/14 23:11
20F：→ NKTcell:RE site多的bp有点少耶 11/15 00:42
21F：推 bluecsky:我不知道你一管装多少 以前lab做都是上百管一次做的 11/15 07:24
22F：→ bluecsky:所以速度不是最大问题 我倒觉得问题可能出在前面的步骤 11/15 07:25
23F：→ bluecsky:或者更可能最原始拿到的sotck菌已经有问题了 所以一路错 11/15 07:25
24F：→ bluecsky:另外电穿孔的机器条件设定你有确认正确吗?弄错也是挂欧 11/15 07:26
25F：→ lier1986:更可靠的competent cell protocol有人可以提供吗? 11/15 12:24
26F：→ lier1986:我现在就是在用TA clone 但是成功率还是很低... 11/15 12:25
27F：→ lier1986:我是有发现放四度C有些白的菌落会变蓝色 但大概要放多久 11/15 12:25
28F：→ lier1986:我知道RE site前多的bp确实是有点少 11/15 12:27
29F：→ lier1986:但多了几个bp就真的做得出来吗...? 11/15 12:28
30F：→ lier1986:stock菌是学长给我的 品系是XL1-blue有什麽方式可以确认 11/15 12:31
31F：→ lier1986:stock对或错吗? 11/15 12:32
32F：→ lier1986:电穿孔的机器设定上应该是没问题的 positive control有 11/15 12:33
33F：→ lier1986:长出很多菌 11/15 12:33
34F：→ lier1986:感谢各位提供的意见 11/15 12:42
35F：→ shenhsu:XL1-blue好像有抗tetracyclin? 可以试一下 11/15 13:09
36F：推 dodomilk:长出很多菌是有多少菌？ 每0.1ng DNA要长出100个colonies 11/15 15:18
37F：→ dodomilk:才能用来作ligation喔！ 11/15 15:18
38F：推 boyo:也许重点在基隆米克斯........... 11/15 21:48
39F：→ GauYi: 台南米格虏 11/15 22:38
40F：→ lier1986:boyo这个id好像有点眼熟...该不会是PTT的那个名人吧@@ 11/16 21:51
41F：→ lier1986:话说 基隆米克斯的东西有什麽问题吗?? 11/16 21:52
42F：推 bluecsky:他的意思是你的kit可能有问题 可以商界别人家的kit试看看 11/17 10:15
43F：→ bluecsky:一般PCR product做TA clone成功率应该不低才是正常的 11/17 10:16
44F：→ bluecsky:competent cell protocol我都参考molecluar cloning做的 11/17 10:16
45F：→ shenhsu:感觉comptent cell问题比较大.... 11/17 14:38
46F：→ lier1986:competent cell是一个大问题没错 我一直摸不着头绪 11/21 14:03
47F：→ lier1986:到底我做的competent cell是哪边出了问题 11/21 14:03
48F：→ lier1986:那我现在在参考molecular cloning的方式 正在尝试 11/21 14:04
49F：→ lier1986:那TA cloning的部分 我之前用的competent cell是学长做的 11/21 14:05
50F：→ lier1986:也确认过他做的competent cell是可以用的 11/21 14:06
51F：→ lier1986:只是效率应该是没有到0.1 ng DNA 长100 colonies这麽高 11/21 14:09
52F：→ lier1986:但在做ligation & transformation後 还是可以长出菌落 11/21 14:10
53F：→ lier1986:可是 蓝白筛中却有很高的伪阳性 问题到底出在哪...? 11/21 14:11
54F：→ keepseaching:原po在做TA clone时 insert前後有没有加A阿？ 11/21 22:39
55F：→ keepseaching:还有去除vector的磷酸根可以防止self-ligation 11/21 22:41
56F：→ lier1986:A应该是有加 我是用Taq polymerase 理论上应该是有 11/22 11:58
57F：→ lier1986:vector是买kit的 里面的plasmid是linear form的 11/22 12:01
58F：→ lier1986:应该也是有用phosphatase处理过的才是... 11/22 12:04