作者nhxcyge (人生就像個不可逆反應)
看板Biotech
標題[求救] site-directed mutagenesis
時間Fri Nov 11 20:28:31 2011
我現在是做A基因的點突變，
用的方法是利用complement primer 25bp，而突變設計在中間
利用這組primer做完pcDNA3-A一整圈plasmid，大小約6.7kb
目前卡在PCR出來的產物很少很少，以致於做transform後都沒有colony長出來…
曾想過把多管PCR產物跑膠(先以DpnI digest)後，把少量的產物集中一起elution
但濃度還是很低(1.1 ng/ul)。
另外因此突變點位在基因末端(離stop codon約30bp,全長約1.4kb)，所以用下述方法
心想應該行不通
F1----------> F2--------->
------------------------------------------------------
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
------------------------------------------------------
R1<---------
R2<----------
二段PCR產物overlap處為mutation site，不過會變成F1、R1夾出來1300多bp而F2、R2
夾出來可能100bp不到的產物，再將二個大小差距那麼大的產物加在一起覺得不太可行。
所以想請問版上有人遇過這種狀況嗎？
Primer重新order過了，Tm值60.XX，PCR用Phusion polymerase。
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.114.202.163
1F：推 icome:跑膠再純會loss非常多 我都直接transform很少失敗 11/11 20:40
2F：→ icome:成功率跟enzyme和competent cll品質有很大關係 11/11 20:42
3F：推 anchi35:有做過1.3Kb+200bp的 也是類似的情形所以用vector的序列 11/11 20:48
4F：→ anchi35:來做PCR 之後再重新接回 11/11 20:50
anchi35大，你是說把primer設計到vector中，離A基因的3'end有一段距離也可以囉？
5F：→ blence:只要reaction及DpnI切完後,跑膠看得到隱約的band就會成功 11/11 20:51
6F：→ blence:不須要purify或concentrate,因此5~10ul reaction是夠用的 11/11 20:55
blence大，你說的我做過，不過沒成功QQ 還是要多做幾次transform看能不能賽到一次XD
※ 編輯: nhxcyge 來自: 140.114.202.163 (11/11 21:24)
7F：推 dodomilk:你是嫩嫩...？ 11/11 22:55