作者nhxcyge (人生就像个不可逆反应)
看板Biotech
标题[求救] site-directed mutagenesis
时间Fri Nov 11 20:28:31 2011
我现在是做A基因的点突变，
用的方法是利用complement primer 25bp，而突变设计在中间
利用这组primer做完pcDNA3-A一整圈plasmid，大小约6.7kb
目前卡在PCR出来的产物很少很少，以致於做transform後都没有colony长出来…
曾想过把多管PCR产物跑胶(先以DpnI digest)後，把少量的产物集中一起elution
但浓度还是很低(1.1 ng/ul)。
另外因此突变点位在基因末端(离stop codon约30bp,全长约1.4kb)，所以用下述方法
心想应该行不通
F1----------> F2--------->
------------------------------------------------------
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
------------------------------------------------------
R1<---------
R2<----------
二段PCR产物overlap处为mutation site，不过会变成F1、R1夹出来1300多bp而F2、R2
夹出来可能100bp不到的产物，再将二个大小差距那麽大的产物加在一起觉得不太可行。
所以想请问版上有人遇过这种状况吗？
Primer重新order过了，Tm值60.XX，PCR用Phusion polymerase。
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.114.202.163
1F：推 icome:跑胶再纯会loss非常多 我都直接transform很少失败 11/11 20:40
2F：→ icome:成功率跟enzyme和competent cll品质有很大关系 11/11 20:42
3F：推 anchi35:有做过1.3Kb+200bp的 也是类似的情形所以用vector的序列 11/11 20:48
4F：→ anchi35:来做PCR 之後再重新接回 11/11 20:50
anchi35大，你是说把primer设计到vector中，离A基因的3'end有一段距离也可以罗？
5F：→ blence:只要reaction及DpnI切完後,跑胶看得到隐约的band就会成功 11/11 20:51
6F：→ blence:不须要purify或concentrate,因此5~10ul reaction是够用的 11/11 20:55
blence大，你说的我做过，不过没成功QQ 还是要多做几次transform看能不能赛到一次XD
※ 编辑: nhxcyge 来自: 140.114.202.163 (11/11 21:24)
7F：推 dodomilk:你是嫩嫩...？ 11/11 22:55