作者wayne841503 (JPG)
看板Biotech
標題[求救] 收磷酸化蛋白問題
時間Mon Nov 7 13:50:27 2011
我目前是在做病毒相關的實驗
用病毒感染細胞後收取蛋白看細胞的表現
最近因為實驗需求需要收磷酸化蛋白~做western
要看eI2a與PERK是否有被磷酸化現象
我的時間點有3、6、9、12、24、36、48小時時間點
我想請問有沒有人試過將細胞以PBS wash完後冰到-80度
之後再一起以RIPA buffer+protease phosphotase inhibitor收下
不知道這方法可不可行?
這樣對磷酸化蛋白會不會有所影響?
還是建議時間點到就單盤單盤收下之後放-80度?
麻煩有做收過類似時間點的人幫我解答一下
感謝萬分~
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◆ From: 140.116.48.124
1F：推 iosteven:我是收下以後進行IP 但都是新鮮做 不冰^^" 11/07 15:55
2F：推 owl628:我是都用RIPA收下來之後冰-80,然後等所有時間點都收齊再做 11/07 16:06
3F：→ owl628:實驗 11/07 16:06
4F：推 antarestar:同上 inhibitor記得要加 11/09 01:53
5F：推 kakaman:不同時間加藥,一起收 11/09 22:20
6F：推 owl628:可是聽說不同時間加藥,有人會介意加藥時細胞不是在同一個條 11/14 17:55
7F：→ owl628:件下進行實驗,不過如果時間沒有差很多我是覺得沒差 11/14 17:56
8F：→ cin:phospho-protein最好要用細胞凍-80度 不要用protein lysate凍 11/15 21:37
9F：→ cin:即使有加 phosphotase inhibitor的lysate 11/15 21:37
10F：→ cin:有些比較敏感的phopho-protein 一樣會掉 11/15 21:37
11F：→ cin:你所說的方法 比較好 只是記得 要把上清液吸乾一點 11/15 21:38
12F：→ cin:當然 新鮮做最好 不過 還是先去冰-80度 11/15 21:40
13F：→ cin:確保所有時間點的細胞都被凍住了 (約五-十分鐘) 再拿出來lyse 11/15 21:41
14F：→ cin:做time course放冰上關signal是不夠的.有些apoptosis訊號會出 11/15 21:42