作者wayne841503 (JPG)
看板Biotech
标题[求救] 收磷酸化蛋白问题
时间Mon Nov 7 13:50:27 2011
我目前是在做病毒相关的实验
用病毒感染细胞後收取蛋白看细胞的表现
最近因为实验需求需要收磷酸化蛋白~做western
要看eI2a与PERK是否有被磷酸化现象
我的时间点有3、6、9、12、24、36、48小时时间点
我想请问有没有人试过将细胞以PBS wash完後冰到-80度
之後再一起以RIPA buffer+protease phosphotase inhibitor收下
不知道这方法可不可行?
这样对磷酸化蛋白会不会有所影响?
还是建议时间点到就单盘单盘收下之後放-80度?
麻烦有做收过类似时间点的人帮我解答一下
感谢万分~
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◆ From: 140.116.48.124
1F：推 iosteven:我是收下以後进行IP 但都是新鲜做 不冰^^" 11/07 15:55
2F：推 owl628:我是都用RIPA收下来之後冰-80,然後等所有时间点都收齐再做 11/07 16:06
3F：→ owl628:实验 11/07 16:06
4F：推 antarestar:同上 inhibitor记得要加 11/09 01:53
5F：推 kakaman:不同时间加药,一起收 11/09 22:20
6F：推 owl628:可是听说不同时间加药,有人会介意加药时细胞不是在同一个条 11/14 17:55
7F：→ owl628:件下进行实验,不过如果时间没有差很多我是觉得没差 11/14 17:56
8F：→ cin:phospho-protein最好要用细胞冻-80度 不要用protein lysate冻 11/15 21:37
9F：→ cin:即使有加 phosphotase inhibitor的lysate 11/15 21:37
10F：→ cin:有些比较敏感的phopho-protein 一样会掉 11/15 21:37
11F：→ cin:你所说的方法 比较好 只是记得 要把上清液吸乾一点 11/15 21:38
12F：→ cin:当然 新鲜做最好 不过 还是先去冰-80度 11/15 21:40
13F：→ cin:确保所有时间点的细胞都被冻住了 (约五-十分钟) 再拿出来lyse 11/15 21:41
14F：→ cin:做time course放冰上关signal是不够的.有些apoptosis讯号会出 11/15 21:42