大家好 小妹目前在進行一段基因的promoter cloning想作promoter assay 其中promoter cloning的3' primer設計有超過這段基因的ATG *目前clone出的圖示: -1936 0 +80 --------------ATG------------ 目前欲將這個clone到的putative promoter接到pGL3 vector上 想請教的是 這段基因是否需要和pGL3上的luciferase共用ATG? 也就是: -----------------------ATG--------------- putative promoter luciferase (畫圖技術不好請見諒><) 但目前發現pGL3 vector map上 luc+位置 只有Nco I 切位 不巧的是 我這個基因片段有兩個Nco I切位阿~!!>< 如果我3' primer 重新設計Nco I切位作PCR, P出這段基因的ATG以前的部分 到時要切Nco I再接到pGL3上,也會一起將我的片段切了orz (有想過就硬著頭皮做酵素切位相同的正反接,但以前實在有很慘痛的回憶orz) 看了已經畢業的學姊論文,發現她沒用Nco I切位, 也就是她將她的promoter直接選兩個pGL3 MCS切位, 接到pGL3 vector上 但問了現在lab中的學長,他說他是將預測的promoter與luciferse共用ATG, 因為luciferase ATG之前的序列都會影響luciferse的活性, 想請問大家 目前該怎麼辦? 要硬做切位相同的cloning嗎? (重點是切了之後 其中兩個片段大小都是七百 根本分不開orz) 謝謝大家>< ~ --

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