大家好 小妹目前在进行一段基因的promoter cloning想作promoter assay 其中promoter cloning的3' primer设计有超过这段基因的ATG *目前clone出的图示: -1936 0 +80 --------------ATG------------ 目前欲将这个clone到的putative promoter接到pGL3 vector上 想请教的是 这段基因是否需要和pGL3上的luciferase共用ATG? 也就是: -----------------------ATG--------------- putative promoter luciferase (画图技术不好请见谅><) 但目前发现pGL3 vector map上 luc+位置 只有Nco I 切位 不巧的是 我这个基因片段有两个Nco I切位阿~!!>< 如果我3' primer 重新设计Nco I切位作PCR, P出这段基因的ATG以前的部分 到时要切Nco I再接到pGL3上,也会一起将我的片段切了orz (有想过就硬着头皮做酵素切位相同的正反接,但以前实在有很惨痛的回忆orz) 看了已经毕业的学姊论文,发现她没用Nco I切位, 也就是她将她的promoter直接选两个pGL3 MCS切位, 接到pGL3 vector上 但问了现在lab中的学长,他说他是将预测的promoter与luciferse共用ATG, 因为luciferase ATG之前的序列都会影响luciferse的活性, 想请问大家 目前该怎麽办? 要硬做切位相同的cloning吗? (重点是切了之後 其中两个片段大小都是七百 根本分不开orz) 谢谢大家>< ~ --

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