作者birdddd (3D正夯~我是3D鳥)
看板Biotech
標題[討論] 抽取組織RNA的步驟
時間Fri Oct 14 00:11:39 2011
我跟我同學是跟不同學姐學抽RNA的技術
我們使用的藥劑也都幾乎相同
但是現在在準備實習課時
卻發現我們的步驟與ㄧ些小技巧不太相同
不曉得是否會有影響
因此上來請教一下大家
以下是抽取RNA的步驟
1. 取小塊的組織，加入500ul Trizol與少量鎬珠均質
2. 均質到無塊狀組織後，再加入500ul Trizol混和均勻，冰上靜置10min
3. 12000g，4度C，離心10min
4. 吸取上清液與100ul BCP混和，再12000g，4度C，離心10min
A:vortex 15sec，室溫下靜置10~15min，再重複此步驟一次
B:vortex，冰上靜置15min
5. 吸取上清液與500ul isopopenol，輕搖混勻，-20度C overnight
6. 12000g離心10min
A:室溫的離心機
B:4度C離心機
7. 倒掉上清液，使用DEPC水配製的75%酒精清洗(-20度C的酒精)，再12000g離心10min
A:倒掉上清液，只用酒精潤洗，重複此步驟一次
B:使用酒精將pellet沖散到看不到
8. 倒掉酒精後讓其pellet air dry，加入DEPC水回溶
A:讓pellet半乾，仍有點濕潤加DEPC水回溶，使用55~65度C乾熱板加熱
B:放到全乾，接者加入DEPC水回溶，使用65度C水浴加熱
是否可使用真空乾燥機?
9. 測核酸濃度，並進行DNA digestion
Q:260/280有時大於2.0，為什麼會這樣呀?
Q:跑膠的時機是在digestion前還是後呢?兩個都有聽過耶
10.DNA digestion後進行DNase Inactivation5min，接者離心
皆使用ABI DNA-free kit
DNase Inactivation Reagent是使用白色微粒
A:Inactivation時輕彈管壁後在室溫下靜置
B:Inactivation時輕彈管壁後在冰上靜置
C:Inactivation時vortex後在室溫下靜置
11.吸取上清液後測核酸濃度，轉cDNA
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◆ From: 111.184.26.55
1F：推 ararthur:步驟跟我們lab的也很不一樣 不過就我而言 如果是組織我會 10/14 01:10
2F：→ ararthur:盡量on ice 尤其不好抽的部位 不過如果跑膠quality很好的 10/14 01:11
3F：→ ararthur:話 放室溫也沒影響了不是嗎? (我是cell line 室溫抽 tiss 10/14 01:12
4F：→ ararthur:-ue 全程on ice) BTW 跑膠和260/230 or 280 沒有絕對關係 10/14 01:13
5F：→ ararthur:我的經驗是都要看 但跑膠重要些 10/14 01:13
跑膠這步驟
學姐是說可跑可不跑
如果是要做clone就一定要確認quality
但260/280一定要看
太差的就要重抽
6F：推 huuban:8.可以真空抽乾，但時間要拿捏好，太乾可能很難溶解 10/14 01:40
7F：→ huuban:9.1大於2.0，以前有聽說這可能是酒精殘留造成的結果 10/14 01:41
8F：→ huuban:9.2應該前後都要跑，才能確定RNA狀況及DNase處理狀況 10/14 01:42
9F：→ huuban:10如果你說的是resin的話，我之前是在5分鐘輕拍保持它懸浮 10/14 01:43
10F：→ huuban:如果不曉得會不會有影響，最好的方式就是都抽一次再一起比 10/14 01:44
11F：→ huuban:我覺得你可以參考一下原始的protocol...再討論被改過的地方 10/14 01:47
"260/280 ratio>2是酒精殘留"--->這說法我有聽過，但是找不到來源耶
所以有點存保留態度
另外
不曉得你說的"5分鐘輕拍保持它懸浮"
是一直一直輕拍
沒有靜置的動作嗎?
至於參考原始protocol
操作前我有看產品的protocol
但是有些字眼其實很模糊
像是wash.mix well.incubate
因此就產生了不同的做法
12F：推 nixo:加Trizol均質後在室溫離心應該是沒問題的，這時各種酶都變性 10/14 01:51
13F：→ nixo:但是去掉Trizol後就要注意了。 10/14 01:52
加了DEPC水不是也可以抑制RNase嗎??
有的步驟是寫說"room templature"
離心就要改成低溫嗎?
甚至於我還聽到學姐說
protocol上的室溫其實是on ice的意思
因為全程本來就應該on ice
(那麼某些步驟刻意寫on ice或者4度C的意義是...?)
14F：→ huuban:TRIzol的protocol好像是寫15-30度都可以吧..忘記了 10/14 22:08
15F：→ huuban:我有試過比較室溫和on ice, 在我們的樣本是沒差 10/14 22:12
16F：→ huuban:我自己抽TRIzol時它寫室溫我就室溫，4度就4度 10/14 22:14
17F：→ huuban:但RNA還是要看樣本，我想有些樣本可能比較難處理 10/14 22:15
看來還是照著產品protocol最安心
可能每個人都有自己的改良方法
結果一直流傳下去就越改越多了
18F：推 magicaries:加DPEC水不能抑制RNase，它是確保你加進去的水無RNase 10/15 09:41
19F：→ magicaries:DPEC在滅完菌之後就沒了 10/15 09:41
這部分真是我很大的疏忽耶!
我剛才查了一下DEPC水的功用
才發現原來我一直觀念錯誤
我還以為"DEPC水"可以當成去除RNase的噴劑
還想說買那種貴鬆鬆的噴劑幹嘛
※ 編輯: birdddd 來自: 115.43.43.95 (10/16 00:40)