作者birdddd (3D正夯~我是3D鸟)
看板Biotech
标题[讨论] 抽取组织RNA的步骤
时间Fri Oct 14 00:11:39 2011
我跟我同学是跟不同学姐学抽RNA的技术
我们使用的药剂也都几乎相同
但是现在在准备实习课时
却发现我们的步骤与ㄧ些小技巧不太相同
不晓得是否会有影响
因此上来请教一下大家
以下是抽取RNA的步骤
1. 取小块的组织，加入500ul Trizol与少量镐珠均质
2. 均质到无块状组织後，再加入500ul Trizol混和均匀，冰上静置10min
3. 12000g，4度C，离心10min
4. 吸取上清液与100ul BCP混和，再12000g，4度C，离心10min
A:vortex 15sec，室温下静置10~15min，再重复此步骤一次
B:vortex，冰上静置15min
5. 吸取上清液与500ul isopopenol，轻摇混匀，-20度C overnight
6. 12000g离心10min
A:室温的离心机
B:4度C离心机
7. 倒掉上清液，使用DEPC水配制的75%酒精清洗(-20度C的酒精)，再12000g离心10min
A:倒掉上清液，只用酒精润洗，重复此步骤一次
B:使用酒精将pellet冲散到看不到
8. 倒掉酒精後让其pellet air dry，加入DEPC水回溶
A:让pellet半乾，仍有点湿润加DEPC水回溶，使用55~65度C乾热板加热
B:放到全乾，接者加入DEPC水回溶，使用65度C水浴加热
是否可使用真空乾燥机?
9. 测核酸浓度，并进行DNA digestion
Q:260/280有时大於2.0，为什麽会这样呀?
Q:跑胶的时机是在digestion前还是後呢?两个都有听过耶
10.DNA digestion後进行DNase Inactivation5min，接者离心
皆使用ABI DNA-free kit
DNase Inactivation Reagent是使用白色微粒
A:Inactivation时轻弹管壁後在室温下静置
B:Inactivation时轻弹管壁後在冰上静置
C:Inactivation时vortex後在室温下静置
11.吸取上清液後测核酸浓度，转cDNA
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◆ From: 111.184.26.55
1F：推 ararthur:步骤跟我们lab的也很不一样 不过就我而言 如果是组织我会 10/14 01:10
2F：→ ararthur:尽量on ice 尤其不好抽的部位 不过如果跑胶quality很好的 10/14 01:11
3F：→ ararthur:话 放室温也没影响了不是吗? (我是cell line 室温抽 tiss 10/14 01:12
4F：→ ararthur:-ue 全程on ice) BTW 跑胶和260/230 or 280 没有绝对关系 10/14 01:13
5F：→ ararthur:我的经验是都要看 但跑胶重要些 10/14 01:13
跑胶这步骤
学姐是说可跑可不跑
如果是要做clone就一定要确认quality
但260/280一定要看
太差的就要重抽
6F：推 huuban:8.可以真空抽乾，但时间要拿捏好，太乾可能很难溶解 10/14 01:40
7F：→ huuban:9.1大於2.0，以前有听说这可能是酒精残留造成的结果 10/14 01:41
8F：→ huuban:9.2应该前後都要跑，才能确定RNA状况及DNase处理状况 10/14 01:42
9F：→ huuban:10如果你说的是resin的话，我之前是在5分钟轻拍保持它悬浮 10/14 01:43
10F：→ huuban:如果不晓得会不会有影响，最好的方式就是都抽一次再一起比 10/14 01:44
11F：→ huuban:我觉得你可以参考一下原始的protocol...再讨论被改过的地方 10/14 01:47
"260/280 ratio>2是酒精残留"--->这说法我有听过，但是找不到来源耶
所以有点存保留态度
另外
不晓得你说的"5分钟轻拍保持它悬浮"
是一直一直轻拍
没有静置的动作吗?
至於参考原始protocol
操作前我有看产品的protocol
但是有些字眼其实很模糊
像是wash.mix well.incubate
因此就产生了不同的做法
12F：推 nixo:加Trizol均质後在室温离心应该是没问题的，这时各种酶都变性 10/14 01:51
13F：→ nixo:但是去掉Trizol後就要注意了。 10/14 01:52
加了DEPC水不是也可以抑制RNase吗??
有的步骤是写说"room templature"
离心就要改成低温吗?
甚至於我还听到学姐说
protocol上的室温其实是on ice的意思
因为全程本来就应该on ice
(那麽某些步骤刻意写on ice或者4度C的意义是...?)
14F：→ huuban:TRIzol的protocol好像是写15-30度都可以吧..忘记了 10/14 22:08
15F：→ huuban:我有试过比较室温和on ice, 在我们的样本是没差 10/14 22:12
16F：→ huuban:我自己抽TRIzol时它写室温我就室温，4度就4度 10/14 22:14
17F：→ huuban:但RNA还是要看样本，我想有些样本可能比较难处理 10/14 22:15
看来还是照着产品protocol最安心
可能每个人都有自己的改良方法
结果一直流传下去就越改越多了
18F：推 magicaries:加DPEC水不能抑制RNase，它是确保你加进去的水无RNase 10/15 09:41
19F：→ magicaries:DPEC在灭完菌之後就没了 10/15 09:41
这部分真是我很大的疏忽耶!
我刚才查了一下DEPC水的功用
才发现原来我一直观念错误
我还以为"DEPC水"可以当成去除RNase的喷剂
还想说买那种贵松松的喷剂干嘛
※ 编辑: birdddd 来自: 115.43.43.95 (10/16 00:40)