作者spirithorse (咩)
看板Biotech
標題[求救] western小分子蛋白壓不到QQ
時間Wed Oct 12 15:44:23 2011
我的實驗蛋白分子量6 kDa,抗體可觀察到的分子量約15KDa
一抗建議濃度1:100-1:1000 二抗1:2000-1:10000 mouse anti-goat
實驗中: blocking 5% milk;
transfer是commerical buffer(無外加methanol)
70V 1hr
[第一次]一抗1:1000 (in 5% BSA) 二抗1:10000 (in 5% milk)
主要的band完全空白,雜band [gradient gel 2分鐘]
http://ppt.cc/lLN;
[12% SDS gel 10 分鐘]
http://ppt.cc/FZ1I
[老師建議]一抗1:100 (in 5% BSA) 二抗 1:10000 (in 5% milk)
用15% SDS gel跑了之後,(跑一半就收,所以沒有把小分子跑掉的疑慮)
結果不僅10分鐘的雜band很微弱,連我所要看的band都壓不到
因為抗體改成1:100,不知道是否是因為一抗太濃呢?
這個東西壓不出來,題目就做不下去了QQ 請達人幫幫我~
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 125.224.237.33
1F：→ spirithorse:qPCR gap 16 cycles; target 22-25 cycles 10/12 15:46
2F：→ teryit:qPCR +1,會不會是抗體品質問題? 保存期限過期? 10/12 16:07
3F：→ spirithorse:上面的qPCR是我做的,所以覺得都22cycles,怎麼還會壓 10/12 16:47
4F：→ spirithorse:不到,抗體是剛買的SC牌 10/12 16:47
5F：→ cin:倒底在問PCR還是WB? 怎麼上面幾個都在講 cycles? 10/12 16:49
6F：→ cin:還有 transfer是哪一種 semi-dry? 還是 濕式 10/12 16:50
7F：→ cin:另 "跑了"一半就收 跑是指 running不是transfer吧? 10/12 16:50
8F：→ cin:如果是running跑了一半 好像跟有沒有transfer過去 沒有關係 10/12 16:51
謝謝 cin: 因為我先做qPCR,再做western, 所以猜想qPCR可detect到22cycles
應該不會WB看不到.
transfer是溼式, SDS gel running到一半是怕小分子跑太快會先跳海
※ 編輯: spirithorse 來自: 125.224.237.33 (10/12 17:20)
9F：→ shenhsu:有mRNA 也不見得一定會有protein就是了 10/12 19:06
10F：→ cin:我看您貼的兩張圖 我認為是transfer跳海 10/12 19:12
11F：→ cin:不用看bands 請看一條條的背景 小分子的位置 連背景都沒了 10/12 19:13
12F：→ cin:我推測是小分子在transfer跳海 10/12 19:13
13F：→ cin:transfer時 每個分子都是像火車過山洞一樣 10/12 19:14
14F：→ cin:要讓想要的分子之車箱 剛好停在membrabe山洞中 10/12 19:15
15F：→ cin:那該分子的車廂多寡(量多) 速度(分子小較快 膠濃又慢一點) 10/12 19:16
16F：→ cin:都要考量 再調一下條件吧 10/12 19:17
17F：→ cin:最好有positive control 才知道 不是該蛋白沒表現 10/12 19:20
18F：→ robertkoch:改用 NC paper 試試看 10/12 20:25
19F：→ robertkoch:或是PVDF泡 methanol 時泡久一點,水洗一下就泡到 10/12 20:26
20F：→ robertkoch:transfer buffer 10/12 20:26
謝謝以上的建議! ^^*
※ 編輯: spirithorse 來自: 125.224.237.33 (10/12 20:53)
21F：推 agene:建議可以換0.2的PVDF,其實NC對蛋白質的binding capacity較差 10/12 21:25
22F：→ spirithorse:謝謝! 明天我會去查實驗室用的PVDF種類QQ 10/12 21:35
23F：→ robertkoch:一般PVDF都是0.45um, 0.22um的也許可以試試看 10/12 22:56
24F：→ robertkoch:NC paper 在我的經驗中"解析度"會比較好 10/12 22:58
25F：→ robertkoch:你要觀察transfer後,同(或小於)分子量的maker還在不在 10/12 23:01
26F：→ spirithorse:我用的最小marker size 10KDa 是綠色很淡,15KDa看的到 10/12 23:18
27F：→ a001ou:借題請教 有人說transfer的時間太久 蛋白會穿過NC或PVDF 10/13 02:08
28F：→ a001ou:所以效率反而變差 這是真的嗎? 有相關的說明工具書嗎 10/13 02:08
29F：推 boblu:是真的啊 任何免疫染色的工具書都會說吧 10/13 04:10
30F：→ boblu:1. marker 選用最小 band 比你要看的東西更小的 10/13 04:11
31F：→ boblu:2. 整張 membrane 拿去 coomassie blue 染一下 10/13 04:12
32F：→ robertkoch:昨天怎麼落了一個字母!?糟... 10/13 13:29
33F：→ robertkoch:transfer過頭很容易發生在較小的蛋白質上 10/13 13:30
34F：→ robertkoch:如果你要的是小分子,那大分子的marker可以不用管他 10/13 13:32
35F：推 freiburg:覺得transfer過頭 +1 如果實驗室沒有0.22的PVDF 10/13 18:30
36F：→ freiburg:也暫時不想買 放兩張0.45 就可以知道有沒有transfer過頭 10/13 18:32
37F：→ freiburg:如果真的在第二張PVDF看到10kDa marker和你的protein 10/13 18:34
38F：→ freiburg:再去optimize transfer condition 10/13 18:34
39F：→ freiburg:可以調整電壓及時間 但我覺得最有效的是加MeOH在buffer裡 10/13 18:36
40F：→ simonmiho:映像中..transfer buffer 的MeOH含量提高有助於小分子 10/19 23:59
41F：→ simonmiho:的transfer (10%~20%) 10/19 23:59