作者spirithorse (咩)
看板Biotech
标题[求救] western小分子蛋白压不到QQ
时间Wed Oct 12 15:44:23 2011
我的实验蛋白分子量6 kDa,抗体可观察到的分子量约15KDa
一抗建议浓度1:100-1:1000 二抗1:2000-1:10000 mouse anti-goat
实验中: blocking 5% milk;
transfer是commerical buffer(无外加methanol)
70V 1hr
[第一次]一抗1:1000 (in 5% BSA) 二抗1:10000 (in 5% milk)
主要的band完全空白,杂band [gradient gel 2分钟]
http://ppt.cc/lLN;
[12% SDS gel 10 分钟]
http://ppt.cc/FZ1I
[老师建议]一抗1:100 (in 5% BSA) 二抗 1:10000 (in 5% milk)
用15% SDS gel跑了之後,(跑一半就收,所以没有把小分子跑掉的疑虑)
结果不仅10分钟的杂band很微弱,连我所要看的band都压不到
因为抗体改成1:100,不知道是否是因为一抗太浓呢?
这个东西压不出来,题目就做不下去了QQ 请达人帮帮我~
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 125.224.237.33
1F：→ spirithorse:qPCR gap 16 cycles; target 22-25 cycles 10/12 15:46
2F：→ teryit:qPCR +1,会不会是抗体品质问题? 保存期限过期? 10/12 16:07
3F：→ spirithorse:上面的qPCR是我做的,所以觉得都22cycles,怎麽还会压 10/12 16:47
4F：→ spirithorse:不到,抗体是刚买的SC牌 10/12 16:47
5F：→ cin:倒底在问PCR还是WB? 怎麽上面几个都在讲 cycles? 10/12 16:49
6F：→ cin:还有 transfer是哪一种 semi-dry? 还是 湿式 10/12 16:50
7F：→ cin:另 "跑了"一半就收 跑是指 running不是transfer吧? 10/12 16:50
8F：→ cin:如果是running跑了一半 好像跟有没有transfer过去 没有关系 10/12 16:51
谢谢 cin: 因为我先做qPCR,再做western, 所以猜想qPCR可detect到22cycles
应该不会WB看不到.
transfer是湿式, SDS gel running到一半是怕小分子跑太快会先跳海
※ 编辑: spirithorse 来自: 125.224.237.33 (10/12 17:20)
9F：→ shenhsu:有mRNA 也不见得一定会有protein就是了 10/12 19:06
10F：→ cin:我看您贴的两张图 我认为是transfer跳海 10/12 19:12
11F：→ cin:不用看bands 请看一条条的背景 小分子的位置 连背景都没了 10/12 19:13
12F：→ cin:我推测是小分子在transfer跳海 10/12 19:13
13F：→ cin:transfer时 每个分子都是像火车过山洞一样 10/12 19:14
14F：→ cin:要让想要的分子之车箱 刚好停在membrabe山洞中 10/12 19:15
15F：→ cin:那该分子的车厢多寡(量多) 速度(分子小较快 胶浓又慢一点) 10/12 19:16
16F：→ cin:都要考量 再调一下条件吧 10/12 19:17
17F：→ cin:最好有positive control 才知道 不是该蛋白没表现 10/12 19:20
18F：→ robertkoch:改用 NC paper 试试看 10/12 20:25
19F：→ robertkoch:或是PVDF泡 methanol 时泡久一点,水洗一下就泡到 10/12 20:26
20F：→ robertkoch:transfer buffer 10/12 20:26
谢谢以上的建议! ^^*
※ 编辑: spirithorse 来自: 125.224.237.33 (10/12 20:53)
21F：推 agene:建议可以换0.2的PVDF,其实NC对蛋白质的binding capacity较差 10/12 21:25
22F：→ spirithorse:谢谢! 明天我会去查实验室用的PVDF种类QQ 10/12 21:35
23F：→ robertkoch:一般PVDF都是0.45um, 0.22um的也许可以试试看 10/12 22:56
24F：→ robertkoch:NC paper 在我的经验中"解析度"会比较好 10/12 22:58
25F：→ robertkoch:你要观察transfer後,同(或小於)分子量的maker还在不在 10/12 23:01
26F：→ spirithorse:我用的最小marker size 10KDa 是绿色很淡,15KDa看的到 10/12 23:18
27F：→ a001ou:借题请教 有人说transfer的时间太久 蛋白会穿过NC或PVDF 10/13 02:08
28F：→ a001ou:所以效率反而变差 这是真的吗? 有相关的说明工具书吗 10/13 02:08
29F：推 boblu:是真的啊 任何免疫染色的工具书都会说吧 10/13 04:10
30F：→ boblu:1. marker 选用最小 band 比你要看的东西更小的 10/13 04:11
31F：→ boblu:2. 整张 membrane 拿去 coomassie blue 染一下 10/13 04:12
32F：→ robertkoch:昨天怎麽落了一个字母!?糟... 10/13 13:29
33F：→ robertkoch:transfer过头很容易发生在较小的蛋白质上 10/13 13:30
34F：→ robertkoch:如果你要的是小分子,那大分子的marker可以不用管他 10/13 13:32
35F：推 freiburg:觉得transfer过头 +1 如果实验室没有0.22的PVDF 10/13 18:30
36F：→ freiburg:也暂时不想买 放两张0.45 就可以知道有没有transfer过头 10/13 18:32
37F：→ freiburg:如果真的在第二张PVDF看到10kDa marker和你的protein 10/13 18:34
38F：→ freiburg:再去optimize transfer condition 10/13 18:34
39F：→ freiburg:可以调整电压及时间 但我觉得最有效的是加MeOH在buffer里 10/13 18:36
40F：→ simonmiho:映像中..transfer buffer 的MeOH含量提高有助於小分子 10/19 23:59
41F：→ simonmiho:的transfer (10%~20%) 10/19 23:59