※ 引述《diffa2 (Zero)》之銘言： : 目前遇到與protein 純化的問題，我使用His-tag / Ni-NTA來純化，在induction : 後protein有明顯的表現量，經破菌後也在supernatant中，但在之後的binding上， : protein卻無法binding，大部分都在flow through中，之後的binding buffer也有 : 少量的protein沖出，elutein 有非常微弱的band : 純化後的protein需保持其功能，不希望以Urea來denature再renature，希望各位可以提 : 供 : 一些經驗與資訊 : 所使用的是Rosetta菌株，用LB medium total 2L(500ml 分四瓶)以1:100放大1.5hr後 : 0.1 mM IPTG induce 3~4小時，之後4度C離心， : 以下是我的純化方式 (用針筒自己packing) : beads 5ml (reuse) 有經strip或是regeneration (兩種都無法bind) : 15 ml binding buffer (5 mM imidazole) : 25 ml 0.1 M NiSO4 : 15 ml binding buffer : 10 ml sample (in binding buffer) : 25 ml binding buffer : 25 ml wash buffer (60 mM imidazole) wash 3 次 : 13 ml elution buffer (400 mM imidazole ) : 每個過後的buffer都取32ul跑膠，用coomassie bleue染色flow throug和supernatant量 : 差不多，之後的binding buffer也有點，最後的Elution中有非常非常微弱的band... : 希望各位可以提供幫助 謝謝><" 有幾種建議： 1) 增加6xHis為10xHis 這個方法在一些paper上有討論過 2) 提高binding buffer的鹽濃度（如 加1~1.5M NaCl）。這個方法對DNA或RNA binding protein特別有效。 3) 先用Ammonium sulfate梯度 找到沈澱目標蛋白濃度 再回溶做binding --

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