※ 引述《diffa2 (Zero)》之铭言： : 目前遇到与protein 纯化的问题，我使用His-tag / Ni-NTA来纯化，在induction : 後protein有明显的表现量，经破菌後也在supernatant中，但在之後的binding上， : protein却无法binding，大部分都在flow through中，之後的binding buffer也有 : 少量的protein冲出，elutein 有非常微弱的band : 纯化後的protein需保持其功能，不希望以Urea来denature再renature，希望各位可以提 : 供 : 一些经验与资讯 : 所使用的是Rosetta菌株，用LB medium total 2L(500ml 分四瓶)以1:100放大1.5hr後 : 0.1 mM IPTG induce 3~4小时，之後4度C离心， : 以下是我的纯化方式 (用针筒自己packing) : beads 5ml (reuse) 有经strip或是regeneration (两种都无法bind) : 15 ml binding buffer (5 mM imidazole) : 25 ml 0.1 M NiSO4 : 15 ml binding buffer : 10 ml sample (in binding buffer) : 25 ml binding buffer : 25 ml wash buffer (60 mM imidazole) wash 3 次 : 13 ml elution buffer (400 mM imidazole ) : 每个过後的buffer都取32ul跑胶，用coomassie bleue染色flow throug和supernatant量 : 差不多，之後的binding buffer也有点，最後的Elution中有非常非常微弱的band... : 希望各位可以提供帮助 谢谢><" 有几种建议： 1) 增加6xHis为10xHis 这个方法在一些paper上有讨论过 2) 提高binding buffer的盐浓度（如 加1~1.5M NaCl）。这个方法对DNA或RNA binding protein特别有效。 3) 先用Ammonium sulfate梯度 找到沈淀目标蛋白浓度 再回溶做binding --

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