作者diffa2 (Zero)
看板Biotech
標題[求救] His-tag protein 純化 無法binding
時間Fri Oct 7 20:34:25 2011
目前遇到與protein 純化的問題，我使用His-tag / Ni-NTA來純化，在induction
後protein有明顯的表現量，經破菌後也在supernatant中，但在之後的binding上，
protein卻無法binding，大部分都在flow through中，之後的binding buffer也有
少量的protein沖出，elutein 有非常微弱的band
純化後的protein需保持其功能，不希望以Urea來denature再renature，希望各位可以提
供
一些經驗與資訊
所使用的是Rosetta菌株，用LB medium total 2L(500ml 分四瓶)以1:100放大1.5hr後
0.1 mM IPTG induce 3~4小時，之後4度C離心，
以下是我的純化方式 (用針筒自己packing)
beads 5ml (reuse) 有經strip或是regeneration (兩種都無法bind)
15 ml binding buffer (5 mM imidazole)
25 ml 0.1 M NiSO4
15 ml binding buffer
10 ml sample (in binding buffer)
25 ml binding buffer
25 ml wash buffer (60 mM imidazole) wash 3 次
13 ml elution buffer (400 mM imidazole )
每個過後的buffer都取32ul跑膠，用coomassie bleue染色flow throug和supernatant量
差不多，之後的binding buffer也有點，最後的Elution中有非常非常微弱的band...
希望各位可以提供幫助 謝謝><"
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.115.48.76
1F：→ slash7788:elution請拉梯度 10/07 23:53
2F：推 mattmatt:flow throug是sample binding後剩下的?還是wash buf下來? 10/08 01:18
3F：→ diffa2:elute後的beads也有跑膠 沒有band，flow through為sample 10/08 02:17
4F：→ diffa2:binding 後所流下來的，因為flow through 和supernatant跑 10/08 02:19
5F：→ diffa2:膠後的濃度只有一些些差異，才推測binding能力不好，clone 10/08 02:22
6F：→ diffa2:有送定序，確實是有His-tag存在 10/08 02:23
7F：推 missal:tag跟protein之間的linker弄長點試試 10/09 03:47
8F：→ akongapple:我之前遇到和你一樣的問題，後來我更改了buffer的pH值 12/20 10:52
9F：→ akongapple:後，protein binding 量大增，flow-through幾乎看不到 12/20 10:52
10F：→ akongapple:signal，我把pH值從8.0調到9.5，另外我用的是0.5MCuSO4 12/20 10:54
11F：→ akongapple:我要純化的是 EGFP protein 12/20 10:54