作者diffa2 (Zero)
看板Biotech
标题[求救] His-tag protein 纯化 无法binding
时间Fri Oct 7 20:34:25 2011
目前遇到与protein 纯化的问题，我使用His-tag / Ni-NTA来纯化，在induction
後protein有明显的表现量，经破菌後也在supernatant中，但在之後的binding上，
protein却无法binding，大部分都在flow through中，之後的binding buffer也有
少量的protein冲出，elutein 有非常微弱的band
纯化後的protein需保持其功能，不希望以Urea来denature再renature，希望各位可以提
供
一些经验与资讯
所使用的是Rosetta菌株，用LB medium total 2L(500ml 分四瓶)以1:100放大1.5hr後
0.1 mM IPTG induce 3~4小时，之後4度C离心，
以下是我的纯化方式 (用针筒自己packing)
beads 5ml (reuse) 有经strip或是regeneration (两种都无法bind)
15 ml binding buffer (5 mM imidazole)
25 ml 0.1 M NiSO4
15 ml binding buffer
10 ml sample (in binding buffer)
25 ml binding buffer
25 ml wash buffer (60 mM imidazole) wash 3 次
13 ml elution buffer (400 mM imidazole )
每个过後的buffer都取32ul跑胶，用coomassie bleue染色flow throug和supernatant量
差不多，之後的binding buffer也有点，最後的Elution中有非常非常微弱的band...
希望各位可以提供帮助 谢谢><"
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.115.48.76
1F：→ slash7788:elution请拉梯度 10/07 23:53
2F：推 mattmatt:flow throug是sample binding後剩下的?还是wash buf下来? 10/08 01:18
3F：→ diffa2:elute後的beads也有跑胶 没有band，flow through为sample 10/08 02:17
4F：→ diffa2:binding 後所流下来的，因为flow through 和supernatant跑 10/08 02:19
5F：→ diffa2:胶後的浓度只有一些些差异，才推测binding能力不好，clone 10/08 02:22
6F：→ diffa2:有送定序，确实是有His-tag存在 10/08 02:23
7F：推 missal:tag跟protein之间的linker弄长点试试 10/09 03:47
8F：→ akongapple:我之前遇到和你一样的问题，後来我更改了buffer的pH值 12/20 10:52
9F：→ akongapple:後，protein binding 量大增，flow-through几乎看不到 12/20 10:52
10F：→ akongapple:signal，我把pH值从8.0调到9.5，另外我用的是0.5MCuSO4 12/20 10:54
11F：→ akongapple:我要纯化的是 EGFP protein 12/20 10:54