作者topkofaxion (Cid Hsieh)
看板Biotech
標題[求救] 想問一下板上有沒有人使用過Promega的點突變kit
時間Tue Oct 4 10:01:10 2011
想問一下板上有沒有人使用過Promega的這套kit
GeneEditor in vitro Site-Directed Mutagenesis System (Cat.# Q9280)
最近實驗遇到了瓶頸...
我老闆希望我的論文能夠再補做一些點突變的data
因此下令我去負二十冰箱中找出那套已經過期一年的kit(當初是要給學長做的...結果人\
跑了)
只不過明知道已經過期很久
但我老闆還是希望我能試試看,不然丟了也浪費(資金有限...)
因此我也只好硬著頭皮做 = ="
這套kit可用在所有帶有抗ampicillin gene的plasmids上(應該幾乎都有)
首先是要將雙股DNA變性為單股
再用Mutagenic Oligonucleotide(primer)去跟單股DNA來 annealing
(兩段primer,一個為我的insert,一個是在ampicillin上)
接著再用T4 DNA Polymerase與T4 DNA Ligase來做成完整的雙股DNA
此時的plasmid一股是正常的,另一股是突變過的
先將synthesis與ligation過後的plasmid拿來做transformation
用的是mismath repair minus的 E.coli strain
然後養在LB medium 並加入kit當中所附的antibiotic selection mix
(上面講到的另外一個primer就是為了將原先的ampicillin gene做修改,
改過的gene除了抗amplcillin之外也能抗他所附的antibiotic selection mix)
overnight之後抽plasmid
此時的plasmid為normal跟mutant的混合
所以接著再做第二次的transformation
用的是JM109的 E.coli strain
接著塗盤在含有amplcillin與antibiotic selection mix的plate
最後挑colony定序
目前實驗還卡在第一步的denature跟transformation
denature的步驟是照protocol的方式
先用強鹼反應五分鐘後再用酸來中和
接著加酒精沉澱然後用TE buffer回溶DNA
然後跑膠確認
只不過我跑膠的結果跟手冊上說的很不一樣
上面寫說單股DNA跑得比較快而且會出現smeared的現象
不過我跑膠的結果卻是出現分子量大很多的band,也沒有smeared
做了三次都是一樣的結果
鹼跟酸的溶液也是重配過確定pH值
反正也沒想太多就繼續往下做transformation......
結果~
overnight culture都沒有長,LB還很清澈,然後kit中附的control plasmid也一樣沒有長
目前已經有照troubleshooting中的方式減少antibiotic selection mix的量
然後competent cell也確認有辦法在沒有抗生素的plate上長起來
剩下我能想到的原因就是那兩個enzyme了
怕他放太久已經沒有活性了
想問問板上大大還有甚麼意見跟方法嗎???
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.120.130.104
1F：推 milkpa:不用kit也可以做，primer設計好（突變點在中間），進行PCR 10/04 11:27
2F：→ milkpa:用DpnI把質體（甲基化）切掉，再做self-ligation， 10/04 11:28
3F：→ milkpa:然後transformation就行了，重點在引子設計。 10/04 11:28
4F：→ gryou:推樓上的方法 或用overlaping PCR 即可！ 10/04 11:56
5F：→ topkofaxion:m大說的方法是不是要設計一組互補的引子?? 10/04 13:54
6F：→ topkofaxion:然後重點是competent cell是能夠修復PCR後的nicks 10/04 13:55
7F：→ topkofaxion:competent cell用DH5a也可以嗎?? 10/04 14:04
8F：推 mattmatt:google "QuikChange II" 下載說明書仔細研讀 10/04 18:19
9F：→ mattmatt:照裡面的方法設計primer 然後買一支DpnI 10/04 18:19
10F：→ mattmatt:DpnI切完直接transform到你的DH5a 也不用ligation了 10/04 18:20
11F：→ mattmatt:不需要買他們的kit也可以做 10/04 18:20
12F：推 hangzer:做點突變我推薦Stratagene的pfu 很好做 成功率很高 10/04 18:33
13F：推 williamyang:enzyme當然是推KOD plus neo,快又正確,價錢實惠! 10/04 21:39
14F：推 jsi:不知道現在kit價錢跟自己單買各項材料價錢比起來差多少，當初 10/04 23:29
17F：→ jsi:BTW,polymerase的"準確率和可作用長度"非常重要 DpnI我作用了 10/04 23:38
18F：→ jsi:O/N 效果不錯 挑三中二 也提供給您參考 10/04 23:40
19F：推 mattmatt:順便也推一下NEB的Phusion 錯誤率號稱到4.4*10^-7 10/05 03:21
20F：→ topkofaxion:別家實驗室剛好有pfuTurbo跟DpnI,已經跟他們講好借用 10/05 16:20
21F：→ topkofaxion:一些來試試看了 10/05 16:21
22F：推 smallhowhow:推KOD-Plus 其他enzyme都不夠看 mutation用這隻就對了 10/05 17:16