作者topkofaxion (Cid Hsieh)
看板Biotech
标题[求救] 想问一下板上有没有人使用过Promega的点突变kit
时间Tue Oct 4 10:01:10 2011
想问一下板上有没有人使用过Promega的这套kit
GeneEditor in vitro Site-Directed Mutagenesis System (Cat.# Q9280)
最近实验遇到了瓶颈...
我老板希望我的论文能够再补做一些点突变的data
因此下令我去负二十冰箱中找出那套已经过期一年的kit(当初是要给学长做的...结果人\
跑了)
只不过明知道已经过期很久
但我老板还是希望我能试试看,不然丢了也浪费(资金有限...)
因此我也只好硬着头皮做 = ="
这套kit可用在所有带有抗ampicillin gene的plasmids上(应该几乎都有)
首先是要将双股DNA变性为单股
再用Mutagenic Oligonucleotide(primer)去跟单股DNA来 annealing
(两段primer,一个为我的insert,一个是在ampicillin上)
接着再用T4 DNA Polymerase与T4 DNA Ligase来做成完整的双股DNA
此时的plasmid一股是正常的,另一股是突变过的
先将synthesis与ligation过後的plasmid拿来做transformation
用的是mismath repair minus的 E.coli strain
然後养在LB medium 并加入kit当中所附的antibiotic selection mix
(上面讲到的另外一个primer就是为了将原先的ampicillin gene做修改,
改过的gene除了抗amplcillin之外也能抗他所附的antibiotic selection mix)
overnight之後抽plasmid
此时的plasmid为normal跟mutant的混合
所以接着再做第二次的transformation
用的是JM109的 E.coli strain
接着涂盘在含有amplcillin与antibiotic selection mix的plate
最後挑colony定序
目前实验还卡在第一步的denature跟transformation
denature的步骤是照protocol的方式
先用强硷反应五分钟後再用酸来中和
接着加酒精沉淀然後用TE buffer回溶DNA
然後跑胶确认
只不过我跑胶的结果跟手册上说的很不一样
上面写说单股DNA跑得比较快而且会出现smeared的现象
不过我跑胶的结果却是出现分子量大很多的band,也没有smeared
做了三次都是一样的结果
硷跟酸的溶液也是重配过确定pH值
反正也没想太多就继续往下做transformation......
结果~
overnight culture都没有长,LB还很清澈,然後kit中附的control plasmid也一样没有长
目前已经有照troubleshooting中的方式减少antibiotic selection mix的量
然後competent cell也确认有办法在没有抗生素的plate上长起来
剩下我能想到的原因就是那两个enzyme了
怕他放太久已经没有活性了
想问问板上大大还有甚麽意见跟方法吗???
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.120.130.104
1F：推 milkpa:不用kit也可以做，primer设计好（突变点在中间），进行PCR 10/04 11:27
2F：→ milkpa:用DpnI把质体（甲基化）切掉，再做self-ligation， 10/04 11:28
3F：→ milkpa:然後transformation就行了，重点在引子设计。 10/04 11:28
4F：→ gryou:推楼上的方法 或用overlaping PCR 即可！ 10/04 11:56
5F：→ topkofaxion:m大说的方法是不是要设计一组互补的引子?? 10/04 13:54
6F：→ topkofaxion:然後重点是competent cell是能够修复PCR後的nicks 10/04 13:55
7F：→ topkofaxion:competent cell用DH5a也可以吗?? 10/04 14:04
8F：推 mattmatt:google "QuikChange II" 下载说明书仔细研读 10/04 18:19
9F：→ mattmatt:照里面的方法设计primer 然後买一支DpnI 10/04 18:19
10F：→ mattmatt:DpnI切完直接transform到你的DH5a 也不用ligation了 10/04 18:20
11F：→ mattmatt:不需要买他们的kit也可以做 10/04 18:20
12F：推 hangzer:做点突变我推荐Stratagene的pfu 很好做 成功率很高 10/04 18:33
13F：推 williamyang:enzyme当然是推KOD plus neo,快又正确,价钱实惠! 10/04 21:39
14F：推 jsi:不知道现在kit价钱跟自己单买各项材料价钱比起来差多少，当初 10/04 23:29
17F：→ jsi:BTW,polymerase的"准确率和可作用长度"非常重要 DpnI我作用了 10/04 23:38
18F：→ jsi:O/N 效果不错 挑三中二 也提供给您参考 10/04 23:40
19F：推 mattmatt:顺便也推一下NEB的Phusion 错误率号称到4.4*10^-7 10/05 03:21
20F：→ topkofaxion:别家实验室刚好有pfuTurbo跟DpnI,已经跟他们讲好借用 10/05 16:20
21F：→ topkofaxion:一些来试试看了 10/05 16:21
22F：推 smallhowhow:推KOD-Plus 其他enzyme都不够看 mutation用这只就对了 10/05 17:16