分享一些經驗: 我們實驗室有在做植物與微生物(真菌) 使用的植物種類算一算有十幾種 菌也有三四種以上 抽RNA的方法不外乎TRIzol, spin column, ammonium carbonate 使用起來真的是要看樣本來調整 像TRIzol很容易受到多醣, 二次代謝物, 和水分的影響 讓分離RNA的效果變得很差,甚至pH跑掉無法使用 所以只能抽一些簡單的草本植物物(菸草,阿拉伯芥等) 可以的話使用真空乾燥後的sample會有比較好的效果 但sample合適的話,抽取的效果很好,蛋白和DNA殘留也較低 Spin column的話就是方便又快速 各家廠商都有出一些有特色的抽取kit 也有針對具有多醣或是黏液的植物樣本的解決方案 特別的可能就在他的extraction buffer有調整過 如果以特殊樣品不好抽的,可以考慮找不同廠商問問 這邊就不說廠牌了..因為真的要看樣品來決定 ammonium carbonate算是滿古早的分離RNA的方法 跟CTAB有點像, 同樣做為extraction buffer 然後過PCI/CI去分離核酸, 最後酒精沉澱 我的經驗是分離核酸的能力很強 收到的核酸量都很高 好處是奇奇怪怪的sample都有辦法抽(ex.竹子.仙人掌) 醣類或二次代謝物影響比較小 缺點是耗時費力 然後會分離到不少genomic DNA 一定要用DNase處理過 至於genomic DNA的部分, 以上三種方法都會有gDNA殘留, 無一倖免 如果你是做普通RT-PCR, TRIzol和Spin column所抽的RNA 轉成cDNA後 PCR影響是還好, 但cycle數較高還是可以p出來 若是做Real-time PCR, 則全部都會測到gDNA 而我們實驗室有在用Roche DNase I以及Ambion TURBO DNA-free kit 我個人的感想是TURBO DNA-free kit雖然成本稍高 但處理起來很快, 相對RNA的lost量較少, 但僅適用於少量的RNA樣本 假如下的RNA(含gDNA)量太多,照protocol做完後,PCR還是會測到gDNA 若要使用的話,建議比protocol減少sample量,或是拉長DNase處理時間會比較好 然後加入Inactive reagent後要很小心的回收,才不容易有DNA殘留 這還有個缺點是被digest掉的核酸片段(或dNTPs)會保留在管內, 以吸光值訂量會受影響 而Roche(或別家)的DNase I,去除gDNA效果很強,照protocol建議處理 幾乎不會有gDNA在後續的RT-PCR或Real-time PCR中被測到 缺點就是要過PCI/CI & 酒精沉澱去除DNase,處理比較費時 (不可加熱inactivate, RNA會被化學分解) 但過PCI/CI與酒精沉澱的同時 被digest掉的核酸會順便被去除(片段太小不沉澱) 最後所得到的RNA最為乾淨,定量也不會受影響 若你想回收的片段較大,此時可以配合LiCl做酒精沉澱 可以得到不錯的效果,理由如下,有興趣的可以看一下 http://www.madsci.org/posts/archives/2000-07/965055056.Mb.r.html 大意就是說LiCl沉澱核酸的效果很好(注意同時包含DNA與RNA) 特別針對片段較大的核酸,小片段的核酸和NTP不會被沉澱下來 所以可以得到較純的核酸(如果去鹽有確實) 若搭配DNaseI digest, 剛好可以去除DNA片段,得到乾淨的RNA 所以目前我個人偏好TRIzol/Ammonium carbonate做為buffer抽取RNA 可以得到較大量的RNA, 然後以DNaseI 處理, 過PCI/CI,酒精沉澱 這樣得到的RNA還是比較乾淨 謝謝收看,歡迎討論 --

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