分享一些经验: 我们实验室有在做植物与微生物(真菌) 使用的植物种类算一算有十几种 菌也有三四种以上 抽RNA的方法不外乎TRIzol, spin column, ammonium carbonate 使用起来真的是要看样本来调整 像TRIzol很容易受到多醣, 二次代谢物, 和水分的影响 让分离RNA的效果变得很差,甚至pH跑掉无法使用 所以只能抽一些简单的草本植物物(菸草,阿拉伯芥等) 可以的话使用真空乾燥後的sample会有比较好的效果 但sample合适的话,抽取的效果很好,蛋白和DNA残留也较低 Spin column的话就是方便又快速 各家厂商都有出一些有特色的抽取kit 也有针对具有多醣或是黏液的植物样本的解决方案 特别的可能就在他的extraction buffer有调整过 如果以特殊样品不好抽的,可以考虑找不同厂商问问 这边就不说厂牌了..因为真的要看样品来决定 ammonium carbonate算是满古早的分离RNA的方法 跟CTAB有点像, 同样做为extraction buffer 然後过PCI/CI去分离核酸, 最後酒精沉淀 我的经验是分离核酸的能力很强 收到的核酸量都很高 好处是奇奇怪怪的sample都有办法抽(ex.竹子.仙人掌) 醣类或二次代谢物影响比较小 缺点是耗时费力 然後会分离到不少genomic DNA 一定要用DNase处理过 至於genomic DNA的部分, 以上三种方法都会有gDNA残留, 无一幸免 如果你是做普通RT-PCR, TRIzol和Spin column所抽的RNA 转成cDNA後 PCR影响是还好, 但cycle数较高还是可以p出来 若是做Real-time PCR, 则全部都会测到gDNA 而我们实验室有在用Roche DNase I以及Ambion TURBO DNA-free kit 我个人的感想是TURBO DNA-free kit虽然成本稍高 但处理起来很快, 相对RNA的lost量较少, 但仅适用於少量的RNA样本 假如下的RNA(含gDNA)量太多,照protocol做完後,PCR还是会测到gDNA 若要使用的话,建议比protocol减少sample量,或是拉长DNase处理时间会比较好 然後加入Inactive reagent後要很小心的回收,才不容易有DNA残留 这还有个缺点是被digest掉的核酸片段(或dNTPs)会保留在管内, 以吸光值订量会受影响 而Roche(或别家)的DNase I,去除gDNA效果很强,照protocol建议处理 几乎不会有gDNA在後续的RT-PCR或Real-time PCR中被测到 缺点就是要过PCI/CI & 酒精沉淀去除DNase,处理比较费时 (不可加热inactivate, RNA会被化学分解) 但过PCI/CI与酒精沉淀的同时 被digest掉的核酸会顺便被去除(片段太小不沉淀) 最後所得到的RNA最为乾净,定量也不会受影响 若你想回收的片段较大,此时可以配合LiCl做酒精沉淀 可以得到不错的效果,理由如下,有兴趣的可以看一下 http://www.madsci.org/posts/archives/2000-07/965055056.Mb.r.html 大意就是说LiCl沉淀核酸的效果很好(注意同时包含DNA与RNA) 特别针对片段较大的核酸,小片段的核酸和NTP不会被沉淀下来 所以可以得到较纯的核酸(如果去盐有确实) 若搭配DNaseI digest, 刚好可以去除DNA片段,得到乾净的RNA 所以目前我个人偏好TRIzol/Ammonium carbonate做为buffer抽取RNA 可以得到较大量的RNA, 然後以DNaseI 处理, 过PCI/CI,酒精沉淀 这样得到的RNA还是比较乾净 谢谢收看,欢迎讨论 --

※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc) ◆ From: 118.160.230.84