作者JaShih (Sharon)
看板Biotech
標題[求救] western blot問題
時間Thu Sep 29 19:20:33 2011
最近做western blot一直做不出來，做得很挫折 T^T
雖然之前也在板上爬過不少有關western blot的文
也試過不少方法
不過每次壓出來還是一片白.....
希望版上大家可以幫我看看我的步驟上有沒有哪邊需要改的
謝謝大家 <(_ _)>
--------------------以上是前言分隔線XD-----------------------------------
我要跑的蛋白質主要分子量分布為40-180kDa
separating gel用12%
transfer membrane 是PVDF
transfer步驟:
1.transfer 16V 1hr 4℃
2.blocking 1hr (5% non-fat milk in PBS)
3.一抗 4℃ O/N (稀釋1:1000-1:5000，主要以說明書為主)
4.wash 10 min x 3次
5.二抗 RT 1hr (稀釋1:1000-1:5000，主要以說明書為主)
6.同4
7.ECL作用數秒~3min後壓片
二抗的部分有洗過1hr.2hr.3hr
但是都沒有壓出來
壓片的問題大部分是壓不出來
不過也有遇過幾次黑片的狀況
抗體廠牌...
一抗大部分是R&D system，少部分是santa cruz
二抗是santa cruz (之前爬文santa的抗體好像有點 恩...Orz)
另外，想順便問一下
Ponceau S有沒有哪一家比較便宜阿...
之前問sigma的好貴又好大罐 = = "
謝謝大家 >"<
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.130.93.48
1F：→ gryou:請問是連internal ctrl壓不出來嗎？ 如果是 ECL check 一下 09/29 19:48
2F：→ g010377:先確定internal control可不可以做出來 09/29 20:52
3F：→ spears135:感覺是沒轉印過去 09/29 21:20
4F：推 johanjohan:抗體表示: 09/29 21:42
5F：→ a0946113:感覺沒轉過去+1 可以染看看轉完的gel看殘留量 09/29 22:36
6F：→ cin:marker有過嗎? 180kd不是太好transfer 我也覺得是tran的問題 09/29 22:44
7F：→ cin:你用哪一種transfer semi-dry還是濕式 09/29 22:44
8F：→ cin:ECL不用放那麼久 09/29 22:45
9F：→ cin:二抗 太濃 1:6000起跳 09/29 22:46
10F：→ JaShih:忘了打上去....是用濕式的 09/29 23:30
11F：→ JaShih:目前的狀況是連internal ctrl壓不出來~>"<~ 也有考慮到是否 09/29 23:31
12F：→ JaShih:沒轉過去，但是一樣的條件之前也是有壓成功過@@ 09/29 23:32
13F：→ JaShih:轉完的gel也有染過，gel下半部有變淡或是消失，所以應該有 09/29 23:37
14F：→ JaShih:轉過去.... 09/29 23:37
15F：→ spears135:如果濕式用這樣的條件應該不夠....或是蛋白量的問題 09/30 08:06
16F：推 kcc0606:同意樓上,溼式100V 60min或400ma 90~120min.為甚麼16v?? 09/30 08:44
17F：→ kcc0606:ECL做用時間,加到memebrane後,在暗房看不到螢光 可試5~30 09/30 08:48
18F：→ kcc0606:min 09/30 08:48
19F：→ kcc0606:PVDF 有按照說明書處理嗎?ponceau s 個人覺得沒甚麼用處 09/30 08:51
20F：→ alulu:40-180 為甚麼不用8%就好?? 09/30 09:36
21F：→ gryou:PVDF 染不上ponceau s ＝＝有沒有tran 完的圖？ 09/30 10:02
22F：→ cin:我覺得應該用6% gel 壓片沒有bands應該 壓幾小時才算數 09/30 10:47
23F：→ cin:看J的描述 問題應該真的是在transfer 09/30 10:48
24F：→ cin:tran完應該整片的protein (marker)90%都要過去 09/30 10:48
感謝大家都熱心幫我找問題 QQ
因為我們家很少在做western
(是幾乎沒在做...)
所以很多東西都是別人的，但是好像大家條件都不一樣，所以也搞了很久&很亂 Orz
之所以用16V & 12% gel 就是別家實驗是給的條件
PVDF使用前都有泡過甲醇
蛋白質量是30ug/well，也有試過到60ug/well，但結果一樣白....
有考慮過是不是沒轉過去，但是每次轉完marker都有過去(沒有全部)
所以protein應該也有過去....
(應該吧....= =)
本來懷疑是抗體有問題，所以有跟弘x連絡過
而ponceau s就是他們跟我說的，之所以會想要買也是想確定到底轉的狀況如何
感覺上似乎真的是在transfer的問題...
(我好像誤會弘x了<囧>)
我會用K大的條件再試看看 Orz
另外想問gel用多少%到底要怎麼判斷? 我只知道好像分子量越小要用%越高....
還有gel到底要不要加SDS阿....我看paper有的有加 有的沒加耶@@
(對不起...因為實在太外行了所以問題很多 >"<)
※ 編輯: JaShih 來自: 114.39.28.179 (09/30 11:44)
25F：推 leoblack:PVDF染Ponceau S需要染久一點才染得上,且要fresh的才好染 09/30 11:19
26F：推 bigcat24:感覺transfer有問題 可以的話拿樣品去別家跑(誤) 09/30 14:48
28F：推 rolajohan:一般都會加SDS，特殊狀況才不加 09/30 16:24
29F：推 tengjing:推樓樓上的連結! 10/01 10:48
30F：推 ararthur:16V真的好奇怪... 10/01 12:55
31F：推 robertkoch:16V非常可疑 一般我都是定電流 50mA for O/N 10/04 14:09
32F：→ robertkoch:200mA for 1~2hr 有時我會用100V跑1hr 10/04 14:10
33F：→ robertkoch:重點是 maker 要全部都過去!沒過去代表該kD沒過去 10/04 14:13
34F：推 michealking:16V好低 我都25V以上 200到400mA 最少30分 10/08 21:32
35F：→ michealking:gel的%樹好像molecular cloning有得查 10/08 21:33