作者JaShih (Sharon)
看板Biotech
标题[求救] western blot问题
时间Thu Sep 29 19:20:33 2011
最近做western blot一直做不出来，做得很挫折 T^T
虽然之前也在板上爬过不少有关western blot的文
也试过不少方法
不过每次压出来还是一片白.....
希望版上大家可以帮我看看我的步骤上有没有哪边需要改的
谢谢大家 <(_ _)>
--------------------以上是前言分隔线XD-----------------------------------
我要跑的蛋白质主要分子量分布为40-180kDa
separating gel用12%
transfer membrane 是PVDF
transfer步骤:
1.transfer 16V 1hr 4℃
2.blocking 1hr (5% non-fat milk in PBS)
3.一抗 4℃ O/N (稀释1:1000-1:5000，主要以说明书为主)
4.wash 10 min x 3次
5.二抗 RT 1hr (稀释1:1000-1:5000，主要以说明书为主)
6.同4
7.ECL作用数秒~3min後压片
二抗的部分有洗过1hr.2hr.3hr
但是都没有压出来
压片的问题大部分是压不出来
不过也有遇过几次黑片的状况
抗体厂牌...
一抗大部分是R&D system，少部分是santa cruz
二抗是santa cruz (之前爬文santa的抗体好像有点 恩...Orz)
另外，想顺便问一下
Ponceau S有没有哪一家比较便宜阿...
之前问sigma的好贵又好大罐 = = "
谢谢大家 >"<
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.130.93.48
1F：→ gryou:请问是连internal ctrl压不出来吗？ 如果是 ECL check 一下 09/29 19:48
2F：→ g010377:先确定internal control可不可以做出来 09/29 20:52
3F：→ spears135:感觉是没转印过去 09/29 21:20
4F：推 johanjohan:抗体表示: 09/29 21:42
5F：→ a0946113:感觉没转过去+1 可以染看看转完的gel看残留量 09/29 22:36
6F：→ cin:marker有过吗? 180kd不是太好transfer 我也觉得是tran的问题 09/29 22:44
7F：→ cin:你用哪一种transfer semi-dry还是湿式 09/29 22:44
8F：→ cin:ECL不用放那麽久 09/29 22:45
9F：→ cin:二抗 太浓 1:6000起跳 09/29 22:46
10F：→ JaShih:忘了打上去....是用湿式的 09/29 23:30
11F：→ JaShih:目前的状况是连internal ctrl压不出来~>"<~ 也有考虑到是否 09/29 23:31
12F：→ JaShih:没转过去，但是一样的条件之前也是有压成功过@@ 09/29 23:32
13F：→ JaShih:转完的gel也有染过，gel下半部有变淡或是消失，所以应该有 09/29 23:37
14F：→ JaShih:转过去.... 09/29 23:37
15F：→ spears135:如果湿式用这样的条件应该不够....或是蛋白量的问题 09/30 08:06
16F：推 kcc0606:同意楼上,湿式100V 60min或400ma 90~120min.为甚麽16v?? 09/30 08:44
17F：→ kcc0606:ECL做用时间,加到memebrane後,在暗房看不到萤光 可试5~30 09/30 08:48
18F：→ kcc0606:min 09/30 08:48
19F：→ kcc0606:PVDF 有按照说明书处理吗?ponceau s 个人觉得没甚麽用处 09/30 08:51
20F：→ alulu:40-180 为甚麽不用8%就好?? 09/30 09:36
21F：→ gryou:PVDF 染不上ponceau s ＝＝有没有tran 完的图？ 09/30 10:02
22F：→ cin:我觉得应该用6% gel 压片没有bands应该 压几小时才算数 09/30 10:47
23F：→ cin:看J的描述 问题应该真的是在transfer 09/30 10:48
24F：→ cin:tran完应该整片的protein (marker)90%都要过去 09/30 10:48
感谢大家都热心帮我找问题 QQ
因为我们家很少在做western
(是几乎没在做...)
所以很多东西都是别人的，但是好像大家条件都不一样，所以也搞了很久&很乱 Orz
之所以用16V & 12% gel 就是别家实验是给的条件
PVDF使用前都有泡过甲醇
蛋白质量是30ug/well，也有试过到60ug/well，但结果一样白....
有考虑过是不是没转过去，但是每次转完marker都有过去(没有全部)
所以protein应该也有过去....
(应该吧....= =)
本来怀疑是抗体有问题，所以有跟弘x连络过
而ponceau s就是他们跟我说的，之所以会想要买也是想确定到底转的状况如何
感觉上似乎真的是在transfer的问题...
(我好像误会弘x了<囧>)
我会用K大的条件再试看看 Orz
另外想问gel用多少%到底要怎麽判断? 我只知道好像分子量越小要用%越高....
还有gel到底要不要加SDS阿....我看paper有的有加 有的没加耶@@
(对不起...因为实在太外行了所以问题很多 >"<)
※ 编辑: JaShih 来自: 114.39.28.179 (09/30 11:44)
25F：推 leoblack:PVDF染Ponceau S需要染久一点才染得上,且要fresh的才好染 09/30 11:19
26F：推 bigcat24:感觉transfer有问题 可以的话拿样品去别家跑(误) 09/30 14:48
28F：推 rolajohan:一般都会加SDS，特殊状况才不加 09/30 16:24
29F：推 tengjing:推楼楼上的连结! 10/01 10:48
30F：推 ararthur:16V真的好奇怪... 10/01 12:55
31F：推 robertkoch:16V非常可疑 一般我都是定电流 50mA for O/N 10/04 14:09
32F：→ robertkoch:200mA for 1~2hr 有时我会用100V跑1hr 10/04 14:10
33F：→ robertkoch:重点是 maker 要全部都过去!没过去代表该kD没过去 10/04 14:13
34F：推 michealking:16V好低 我都25V以上 200到400mA 最少30分 10/08 21:32
35F：→ michealking:gel的%树好像molecular cloning有得查 10/08 21:33