※ 引述《chiehdis (chiehhime)》之銘言： : 或許你可以搜尋我ID(小寫a + chiehdis) 看一下是不是類似的問題 : 如果是的話 相關回文可以看一下 那篇作者很厲害 幫助我很多~~ : 另外 基於如何去除gDNA又保持RNA不被降解~提供給你一些我查到的方法： : <<DNase>> : 我們家本來用Ambion Turbo ~ : 方法是加入 enzyme 和 buffer 後 65度 incubate 30分鐘 : 再加入inactivation reagent 4度五分鐘後離心取上清液 : 但RNA濃度和品質受到不小影響~(我想可能是高溫的關係) : (但也很可能是我自己操作的失誤 : 因為有強者同方法依舊得到超好看的電泳和數據~) : 改良方法 : 1.Fermentase 37度 (較低溫) 10分鐘(縮短時間) : 2.Roche 室溫(較低溫) 20分鐘(縮短時間) : 缺點：但是以上兩者皆要過CI 步驟增加 回收量就會少~!! : 3.Ambion 以resin當成inactivation reagent (避免化學或熱傷害RNA) : http://www.ambion.com/techlib/tn/114/10.html 有原理和比較詳細的說明~ : 缺點：聽說奇貴無比!!!! 其實也沒有很貴XD （我們是減量到一組可以用 120 rx'n，這樣一個反應在 30 元左右） （這個版應該可以大約的說一下價錢吧？！） 他的 DNA 活性很好，而且 inactivation reagent 中加有防止 RNA 降解的物質， 所以效果就更好了。 : <<Kit>> : 1.Qiagen 的 column : 缺點： 較貴 且無法操作很大量~~(對我來說~因為我要的量很多!!!) : <<直接在抽取過程中去除DNA>> : 1.TRIzol v.s RNAzol : 這是我打去詢問一個RNA乾燥產品時 sales提供我的~ (可以跟她拿個3ml的sample試用~) : 和粉紅色的TRIzol不同 RNAzol是清澈的藍色液體 : 號稱是TRIzol系列第四代~~ 不用加CI 抽完RNA也不用去DNA : 價錢是TRIzol的兩倍 : 但是依我用來抽取真菌的RNA看來 是沒有DNA汙染 但Nanodrop的值很差~ : 濃度 純度 260/230(我用來看多醣汙染) 都比TRIzol低 這玩意兒真的不大好用。 : 所以就被我丟到一邊了....... : (聽說抽取另一種真菌和植物的quality也都不好...) : 缺點：貴 效果又不佳 : 最後結果 不管是哪種抽取的方式，肯定會有 DNA contamination。 畢竟 RNA 跟 DNA 長得太像了，是絕對不可能完全分開的... Qiagen 的 kit 有兩種， 一種是加 DNase 在 matrix 上處理（當然也可以 elute 後處理） 另一種是配有 gDNA elimination column。 聽說這玩意兒的效果相當好。 你也可以跟 Qiagen 買配合 TRIzol 使用的 kit， 也可以選購 gDNA elimination column。 這樣你就經過兩個步驟去除 DNA contamination (TRIzol phase separation/column) 但這玩意兒真的是貴到...= =" : 後來去找了TRIzol的protocol來看 發現其實它本來就可以去除DNA了!!! : 我有跑過非變性電泳~(抱歉手邊沒圖 有空之後補!!) : 大於1kb的地方都很乾淨~~ : 其實TRIzol可以用來抽DNA DNA在分層的地方應該會被分到有機層 : 所以在分層提取的時候 如同之前文章版友的建議 : 盡量不要吸取到蛋白層的部分 犧牲多一點!!!!! : 就可以避免掉DNA的污染了!!! 其實用 TRIzol 污染超嚴重的。 如果你有處理過原核樣品，真的是相當恐怖... 我自己的經驗是，就算 chloroform 加下去只取 300， 不轉 cDNA 直接拿 RNA sample PCR (negative control) 大概 35 cycles PCR 產物就飽和了... (25 就看的到了) 所以我們是有處理 Turbo DNA-free 而且原核樣品還加長時間處理到 1 小時。 : 以上是我的經驗 如有錯誤 請多指教及海涵~ : 也期望其他版友能提供建議!! : 希望有幫助到你 一起加油吧:) : ※ 引述《cqw80000 (草履蟲)》之銘言： : : 目前的狀況是這樣的,我們實驗室是用TRIzol抽取RNA. : : 抽取的過程中也很順利,RNA跑完電泳後發現有genomic DNA殘留. : : 但是因為要把RNA反轉錄成cDNA,所以目前是先取出要反轉錄的RNA的量出來. : : 取出來後打算加入DNase I於37度C作用30分鐘後,再於65度C作用5分鐘使DNase I失活. : : 我的問題就是在去除genomic DNA的過程中,不知道會不會使RNA降解? : : 假如RNA會降解的話,請問前輩還有什麼方式可以去除已經萃取好的RNA中的genomic DNA. : : 感謝! 做 real-time PCR 用跨 intron 的 primer set， gDNA 還是會被放大， 只是不容易變成倍增狀況而已。 但是這基本上是沒有人可以給你任何的保證。 尤其是你用 sybr green 或其他 DNA binding dye (EvaGreen, LC green... etc) 如果你把 primer 跨 intron，也就是你的 primer 是由兩段 exon 組成頭尾的， 這樣狀況會稍微好點。 但是還是沒辦法保證絕對不會放大出不該放大的片段。 所以我覺得 sample preparation 要盡力到把樣品處理到只剩下 RNA。 讓你的樣本越乾淨越簡單就越好。 接著，如果是持續偵測的基因， 會建議你設計跨 intron 的 TagMan probe or pNA probe， 避免使用 DNA binding dye。 如果不是持續偵測的基因（如初篩） 則建議你除了把 primer 設計跨 intron 外， 在跑完 qPCR 後用電泳膠片確認。 -- --

※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.112.218.141 不要轉 cDNA 直接當 template PCR， 有亮就是有污染。 如果片段只有一兩百...那亮的機會實在是太大了。 其實怎麼處理都難免有殘留... 只是試著把它降到最低而已。 尤其是在 real-time 這種很靈敏的實驗。 ※ 編輯: Rarelay 來自: 140.112.218.141 (09/28 23:57)