※ 引述《chiehdis (chiehhime)》之铭言： : 或许你可以搜寻我ID(小写a + chiehdis) 看一下是不是类似的问题 : 如果是的话 相关回文可以看一下 那篇作者很厉害 帮助我很多~~ : 另外 基於如何去除gDNA又保持RNA不被降解~提供给你一些我查到的方法： : <<DNase>> : 我们家本来用Ambion Turbo ~ : 方法是加入 enzyme 和 buffer 後 65度 incubate 30分钟 : 再加入inactivation reagent 4度五分钟後离心取上清液 : 但RNA浓度和品质受到不小影响~(我想可能是高温的关系) : (但也很可能是我自己操作的失误 : 因为有强者同方法依旧得到超好看的电泳和数据~) : 改良方法 : 1.Fermentase 37度 (较低温) 10分钟(缩短时间) : 2.Roche 室温(较低温) 20分钟(缩短时间) : 缺点：但是以上两者皆要过CI 步骤增加 回收量就会少~!! : 3.Ambion 以resin当成inactivation reagent (避免化学或热伤害RNA) : http://www.ambion.com/techlib/tn/114/10.html 有原理和比较详细的说明~ : 缺点：听说奇贵无比!!!! 其实也没有很贵XD （我们是减量到一组可以用 120 rx'n，这样一个反应在 30 元左右） （这个版应该可以大约的说一下价钱吧？！） 他的 DNA 活性很好，而且 inactivation reagent 中加有防止 RNA 降解的物质， 所以效果就更好了。 : <<Kit>> : 1.Qiagen 的 column : 缺点： 较贵 且无法操作很大量~~(对我来说~因为我要的量很多!!!) : <<直接在抽取过程中去除DNA>> : 1.TRIzol v.s RNAzol : 这是我打去询问一个RNA乾燥产品时 sales提供我的~ (可以跟她拿个3ml的sample试用~) : 和粉红色的TRIzol不同 RNAzol是清澈的蓝色液体 : 号称是TRIzol系列第四代~~ 不用加CI 抽完RNA也不用去DNA : 价钱是TRIzol的两倍 : 但是依我用来抽取真菌的RNA看来 是没有DNA污染 但Nanodrop的值很差~ : 浓度 纯度 260/230(我用来看多醣污染) 都比TRIzol低 这玩意儿真的不大好用。 : 所以就被我丢到一边了....... : (听说抽取另一种真菌和植物的quality也都不好...) : 缺点：贵 效果又不佳 : 最後结果 不管是哪种抽取的方式，肯定会有 DNA contamination。 毕竟 RNA 跟 DNA 长得太像了，是绝对不可能完全分开的... Qiagen 的 kit 有两种， 一种是加 DNase 在 matrix 上处理（当然也可以 elute 後处理） 另一种是配有 gDNA elimination column。 听说这玩意儿的效果相当好。 你也可以跟 Qiagen 买配合 TRIzol 使用的 kit， 也可以选购 gDNA elimination column。 这样你就经过两个步骤去除 DNA contamination (TRIzol phase separation/column) 但这玩意儿真的是贵到...= =" : 後来去找了TRIzol的protocol来看 发现其实它本来就可以去除DNA了!!! : 我有跑过非变性电泳~(抱歉手边没图 有空之後补!!) : 大於1kb的地方都很乾净~~ : 其实TRIzol可以用来抽DNA DNA在分层的地方应该会被分到有机层 : 所以在分层提取的时候 如同之前文章版友的建议 : 尽量不要吸取到蛋白层的部分 牺牲多一点!!!!! : 就可以避免掉DNA的污染了!!! 其实用 TRIzol 污染超严重的。 如果你有处理过原核样品，真的是相当恐怖... 我自己的经验是，就算 chloroform 加下去只取 300， 不转 cDNA 直接拿 RNA sample PCR (negative control) 大概 35 cycles PCR 产物就饱和了... (25 就看的到了) 所以我们是有处理 Turbo DNA-free 而且原核样品还加长时间处理到 1 小时。 : 以上是我的经验 如有错误 请多指教及海涵~ : 也期望其他版友能提供建议!! : 希望有帮助到你 一起加油吧:) : ※ 引述《cqw80000 (草履虫)》之铭言： : : 目前的状况是这样的,我们实验室是用TRIzol抽取RNA. : : 抽取的过程中也很顺利,RNA跑完电泳後发现有genomic DNA残留. : : 但是因为要把RNA反转录成cDNA,所以目前是先取出要反转录的RNA的量出来. : : 取出来後打算加入DNase I於37度C作用30分钟後,再於65度C作用5分钟使DNase I失活. : : 我的问题就是在去除genomic DNA的过程中,不知道会不会使RNA降解? : : 假如RNA会降解的话,请问前辈还有什麽方式可以去除已经萃取好的RNA中的genomic DNA. : : 感谢! 做 real-time PCR 用跨 intron 的 primer set， gDNA 还是会被放大， 只是不容易变成倍增状况而已。 但是这基本上是没有人可以给你任何的保证。 尤其是你用 sybr green 或其他 DNA binding dye (EvaGreen, LC green... etc) 如果你把 primer 跨 intron，也就是你的 primer 是由两段 exon 组成头尾的， 这样状况会稍微好点。 但是还是没办法保证绝对不会放大出不该放大的片段。 所以我觉得 sample preparation 要尽力到把样品处理到只剩下 RNA。 让你的样本越乾净越简单就越好。 接着，如果是持续侦测的基因， 会建议你设计跨 intron 的 TagMan probe or pNA probe， 避免使用 DNA binding dye。 如果不是持续侦测的基因（如初筛） 则建议你除了把 primer 设计跨 intron 外， 在跑完 qPCR 後用电泳胶片确认。 -- --

※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc) ◆ From: 140.112.218.141 不要转 cDNA 直接当 template PCR， 有亮就是有污染。 如果片段只有一两百...那亮的机会实在是太大了。 其实怎麽处理都难免有残留... 只是试着把它降到最低而已。 尤其是在 real-time 这种很灵敏的实验。 ※ 编辑: Rarelay 来自: 140.112.218.141 (09/28 23:57)