作者shienn (西恩)
看板Biotech
標題[求救] PCR產物的smear
時間Sat Sep 24 01:01:12 2011
最近要篩選帶有點突變的一段序列
其中positive control一直跑不出來(就是用primer夾無點突變的wild type)
用gradient跑出來也全部smear
但我很確定我抽的wild type DNA沒有被degraded
因為篩其他的片段都沒問題
偏偏就這個跑不出來
至於我的PCR是
primer1(10uM) 0.5ul
primer2(10uM) 0.5ul
dNTP(2.5mM) 1ul
10x buffer 2.5ul
Taq 0.5ul
ddH2O 19ul
template 1ul
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total 25ul
之前想說會不會是template濃度太高 所以有減半過但還是smear很嚴重
請問除了annealing溫度 template濃度之外還有甚麼因素呢@@?
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.112.230.173
1F：推 oxoox:DNA濃度高的時候減半還是太多 請十倍稀釋 09/24 03:16
2F：推 mattmatt:你要不要先把reagent.DNA.primer等濃度列出再來討論? 09/24 05:43
補了
3F：→ Ianthegood:一般用gDNA跑的都是先稀釋過好幾個0耶 條件列出來吧 09/24 07:34
但用其他primer夾其他的片段都沒問題~"~
而這個primer設計上應該也沒問題
因為之前學長也跑出來過
就是不知道問題出在哪...
感謝回答~~~
4F：推 yuyao:primer conc.應該是uM吧?是筆誤還是真的用mM. 09/24 10:12
抱歉筆誤 冏
5F：推 sunnyforever:buffer裡面就含有Mg2+了嗎? 金屬離子也可能影響到 09/24 10:52
buffer是否有Mg2+ 這我就不清楚... 那我去實驗室的時候注意看看
※ 編輯: shienn 來自: 140.112.4.200 (09/24 11:15)
6F：推 yuyao:有沒有可能primer壞了，重新拿stock稀釋或從訂。 09/24 11:22
7F：→ sancra:所以template濃度到底是多少?? 09/24 12:36
8F：→ Ianthegood:對阿template濃度到底是多少 09/24 20:11
9F：→ Ianthegood:還有program跟expected size也列一下 09/24 20:12
10F：推 Realthugz:反應時間? 09/24 23:43