作者shienn (西恩)
看板Biotech
标题[求救] PCR产物的smear
时间Sat Sep 24 01:01:12 2011
最近要筛选带有点突变的一段序列
其中positive control一直跑不出来(就是用primer夹无点突变的wild type)
用gradient跑出来也全部smear
但我很确定我抽的wild type DNA没有被degraded
因为筛其他的片段都没问题
偏偏就这个跑不出来
至於我的PCR是
primer1(10uM) 0.5ul
primer2(10uM) 0.5ul
dNTP(2.5mM) 1ul
10x buffer 2.5ul
Taq 0.5ul
ddH2O 19ul
template 1ul
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total 25ul
之前想说会不会是template浓度太高 所以有减半过但还是smear很严重
请问除了annealing温度 template浓度之外还有甚麽因素呢@@?
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.112.230.173
1F：推 oxoox:DNA浓度高的时候减半还是太多 请十倍稀释 09/24 03:16
2F：推 mattmatt:你要不要先把reagent.DNA.primer等浓度列出再来讨论? 09/24 05:43
补了
3F：→ Ianthegood:一般用gDNA跑的都是先稀释过好几个0耶 条件列出来吧 09/24 07:34
但用其他primer夹其他的片段都没问题~"~
而这个primer设计上应该也没问题
因为之前学长也跑出来过
就是不知道问题出在哪...
感谢回答~~~
4F：推 yuyao:primer conc.应该是uM吧?是笔误还是真的用mM. 09/24 10:12
抱歉笔误 冏
5F：推 sunnyforever:buffer里面就含有Mg2+了吗? 金属离子也可能影响到 09/24 10:52
buffer是否有Mg2+ 这我就不清楚... 那我去实验室的时候注意看看
※ 编辑: shienn 来自: 140.112.4.200 (09/24 11:15)
6F：推 yuyao:有没有可能primer坏了，重新拿stock稀释或从订。 09/24 11:22
7F：→ sancra:所以template浓度到底是多少?? 09/24 12:36
8F：→ Ianthegood:对阿template浓度到底是多少 09/24 20:11
9F：→ Ianthegood:还有program跟expected size也列一下 09/24 20:12
10F：推 Realthugz:反应时间? 09/24 23:43