作者Drabbit (Drabbit)
看板Biotech
標題[求救] 抽plasmid之後的sample確認 我的電泳爆走了
時間Mon Sep 19 17:09:09 2011
大家好
初次在板上發文 請海含
小妹所學不多 想請各位高手給些意見
以下就直接切入重點了
小妹最近抽了兩次的plasmid要送做定序用
步驟大致上如下：
首先先將sample做DNA純化(有二次電泳確認UV下沒有切到雜訊)
然後Ligation
接著Transformation
等藍白篩結果出來後
選取白色的菌落至50 ml falcon tube培養
然後隔天跟著kit上的步驟抽plasmid
最後一步是加 50 ul Elution buffer 存放在-20度C
為了確認sample是否是我們要的
會再做第三次的電泳確認
問題就在這了!!!!!
我的膠圖像是被附身一樣
以下是我最後跑膠的condution和圖片：
第一次
gel:1%
內染:EtBr 1 ul(小片膠)
電泳:95 V/35 min
loading dye:3 ul
sample:5 ul
marker:3 ul
http://ppt.cc/XF2x
結果像是跑出了一堆彗星
不過送定序後到沒有什麼問題
第二次
gel:2% (我猜測跟膠濃度有關 因此改為2%)
內染:EtBr 2 ul(大片膠)
電泳:95 V/35 min
loading dye:3 ul
sample:3 ul (推測可能是上次sample加太多 因此減少)
marker:3 ul
http://ppt.cc/Um@S
這次反而跑出像有雜訊的樣子
http://ppt.cc/6XtQ http://ppt.cc/,vZX
可是切膠後的確認確定是沒有切到雜訊的
問題1:
為什麼拖尾巴的情形會這麼嚴重
(一般電泳都不會有這種情形 唯有抽plasmid後的確認才出現)
問題二:
第二次的圖要怎麼解釋比較好
像雜訊的band是雜訊嗎
謝謝大家幫忙解答
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 120.107.166.175
1F：推 HEK293:看起來有點濃稠。阿為什麼是提高膠體濃度？不是應該減少？ 09/19 17:37
2F：→ blence:從"mini用50ml tube"培養,就可以推測整個問題是plasmid太濃 09/19 17:57
3F：推 dodomilk:mini抽出來濃度至少都有300 ng/ul以上吧 你加了3ul... 09/19 18:07
4F：→ dodomilk:應該是你加了太多DNA才會拖尾這麼嚴重 09/19 18:08
5F：→ dodomilk:你看看旁邊的marker，最亮的也才100~150 ng左右而已 09/19 18:09
6F：推 Realthugz:= = overload 實驗室沒人告訴你嗎? 09/19 19:23
7F：推 leoblack:跑gel前DNA都不先測一下濃度嘛!?大概100ng就夠了 09/19 21:24
8F：→ leoblack:另外check plasmid不切成線狀跑~size怎麼會對?! 09/19 21:26
9F：推 kingbar:circular和supercoil form的差別啊~不是雜訊 09/19 22:56
10F：推 qiet:同上 看起來就是太濃而已 09/19 23:47
11F：推 ssuny:plasmid濃度太濃而已.... 09/20 00:19
12F：→ rebirth:overload 另外uncut plasmid不應跑2% gel,0.8%~1%較適合 09/20 00:20
13F：→ sancra:1.overload, 2.plasmid不切，跑出什麼鬼都有可能 09/20 01:46
14F：推 NKTcell:plasmid太濃 09/20 02:27
15F：→ g010377:1.DNA下太濃 2.沒有digest這種現象正常 09/20 09:10
16F：推 Ianthegood:鞭得好兇XD 然後dye加太多有可能跑錯喔 09/20 11:00
17F：推 kingtiger:check的時候下1ul就夠,第一次的gel沒做好 09/20 11:55
謝謝大家的意見!!
DNA和plasmid的測量方式和濃度有經過老師是OK的
我有問他CHECK加3 ul會不會太多
不過老師覺得保險起見
也因為只是要作粗略的測試，所以才沒有測濃度和切成線狀!
感謝K大的解答 我有請問老師了 老師也是這樣說明!!
第一次gel因為臨時改濃度，所以當天配，放得不夠久><
謝謝大家寶貴的意見!!!!
※ 編輯: Drabbit 來自: 120.107.166.175 (09/20 12:56)
18F：推 dodomilk:有時候不要太相信老師的話，畢竟大多數老師離第一線實驗 09/20 21:26
19F：→ dodomilk:工作已經有段時間了，問同樣在做實驗的學長姊比較好 09/20 21:26
20F：推 mattmatt:1.load太多 2.plasmid二級結構 09/24 05:37
21F：→ mattmatt:另外你列出的條件都只有體積沒有濃度 這樣並不是很嚴謹.. 09/24 05:39
22F：→ mattmatt:建議你做實驗都以"濃度"為準則 可以避免很多不必要的麻煩 09/24 05:40