作者Drabbit (Drabbit)
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标题[求救] 抽plasmid之後的sample确认 我的电泳爆走了
时间Mon Sep 19 17:09:09 2011
大家好
初次在板上发文 请海含
小妹所学不多 想请各位高手给些意见
以下就直接切入重点了
小妹最近抽了两次的plasmid要送做定序用
步骤大致上如下：
首先先将sample做DNA纯化(有二次电泳确认UV下没有切到杂讯)
然後Ligation
接着Transformation
等蓝白筛结果出来後
选取白色的菌落至50 ml falcon tube培养
然後隔天跟着kit上的步骤抽plasmid
最後一步是加 50 ul Elution buffer 存放在-20度C
为了确认sample是否是我们要的
会再做第三次的电泳确认
问题就在这了!!!!!
我的胶图像是被附身一样
以下是我最後跑胶的condution和图片：
第一次
gel:1%
内染:EtBr 1 ul(小片胶)
电泳:95 V/35 min
loading dye:3 ul
sample:5 ul
marker:3 ul
http://ppt.cc/XF2x
结果像是跑出了一堆彗星
不过送定序後到没有什麽问题
第二次
gel:2% (我猜测跟胶浓度有关 因此改为2%)
内染:EtBr 2 ul(大片胶)
电泳:95 V/35 min
loading dye:3 ul
sample:3 ul (推测可能是上次sample加太多 因此减少)
marker:3 ul
http://ppt.cc/Um@S
这次反而跑出像有杂讯的样子
http://ppt.cc/6XtQ http://ppt.cc/,vZX
可是切胶後的确认确定是没有切到杂讯的
问题1:
为什麽拖尾巴的情形会这麽严重
(一般电泳都不会有这种情形 唯有抽plasmid後的确认才出现)
问题二:
第二次的图要怎麽解释比较好
像杂讯的band是杂讯吗
谢谢大家帮忙解答
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 120.107.166.175
1F：推 HEK293:看起来有点浓稠。阿为什麽是提高胶体浓度？不是应该减少？ 09/19 17:37
2F：→ blence:从"mini用50ml tube"培养,就可以推测整个问题是plasmid太浓 09/19 17:57
3F：推 dodomilk:mini抽出来浓度至少都有300 ng/ul以上吧 你加了3ul... 09/19 18:07
4F：→ dodomilk:应该是你加了太多DNA才会拖尾这麽严重 09/19 18:08
5F：→ dodomilk:你看看旁边的marker，最亮的也才100~150 ng左右而已 09/19 18:09
6F：推 Realthugz:= = overload 实验室没人告诉你吗? 09/19 19:23
7F：推 leoblack:跑gel前DNA都不先测一下浓度嘛!?大概100ng就够了 09/19 21:24
8F：→ leoblack:另外check plasmid不切成线状跑~size怎麽会对?! 09/19 21:26
9F：推 kingbar:circular和supercoil form的差别啊~不是杂讯 09/19 22:56
10F：推 qiet:同上 看起来就是太浓而已 09/19 23:47
11F：推 ssuny:plasmid浓度太浓而已.... 09/20 00:19
12F：→ rebirth:overload 另外uncut plasmid不应跑2% gel,0.8%~1%较适合 09/20 00:20
13F：→ sancra:1.overload, 2.plasmid不切，跑出什麽鬼都有可能 09/20 01:46
14F：推 NKTcell:plasmid太浓 09/20 02:27
15F：→ g010377:1.DNA下太浓 2.没有digest这种现象正常 09/20 09:10
16F：推 Ianthegood:鞭得好凶XD 然後dye加太多有可能跑错喔 09/20 11:00
17F：推 kingtiger:check的时候下1ul就够,第一次的gel没做好 09/20 11:55
谢谢大家的意见!!
DNA和plasmid的测量方式和浓度有经过老师是OK的
我有问他CHECK加3 ul会不会太多
不过老师觉得保险起见
也因为只是要作粗略的测试，所以才没有测浓度和切成线状!
感谢K大的解答 我有请问老师了 老师也是这样说明!!
第一次gel因为临时改浓度，所以当天配，放得不够久><
谢谢大家宝贵的意见!!!!
※ 编辑: Drabbit 来自: 120.107.166.175 (09/20 12:56)
18F：推 dodomilk:有时候不要太相信老师的话，毕竟大多数老师离第一线实验 09/20 21:26
19F：→ dodomilk:工作已经有段时间了，问同样在做实验的学长姊比较好 09/20 21:26
20F：推 mattmatt:1.load太多 2.plasmid二级结构 09/24 05:37
21F：→ mattmatt:另外你列出的条件都只有体积没有浓度 这样并不是很严谨.. 09/24 05:39
22F：→ mattmatt:建议你做实验都以"浓度"为准则 可以避免很多不必要的麻烦 09/24 05:40