作者ararthur ()
看板Biotech
標題[求救] Ligation
時間Tue Sep 13 12:35:13 2011
Insert 大小為1.5k 已放入TA裡
Vector pcDNA3.1(+) 大小為5.5k
比較麻煩的是 Insert和Vector可以用的cut site有點複雜
→
---+-----+-[ gene ]-+-----+--- Insert-pGEM-T easy
EcoRI
BamHI Hind3
EcoRI
→
------------+----+------------ Vector pcDNA3.1(+)
BamHI EcoRI
(G/GATCC)--17nt--(G/AATTC)
我以BamHI 和EcoRI作為連結處
Digestion protocol為
Insert(10ug~30ug) BamHI先切 1hr 再加入EcoRI 並補滿buf 再切2hr
^此步有先取1ul出來跑膠 確定有切完
Vector(10ug~30ug) BamHI+EcoRI 同時切3hr
gel extraction >
ligation (molar ratio=1:1, 1:3, 3:1) RT 3hr >
transformation
positive control丟約200ng 長滿長片
ligation p/c 用vector切一刀 丟40ng去ligation 約有500顆
但實驗組永遠都只有1~2顆的colonies
而且抽出來size都不正確
想請問這些實驗步驟中有沒有什麼問題?
會不會是Vector的兩個cut size太近 時間太短?
還是可能是Ligation步驟問題?
謝謝各位:)
祝大家實驗順利
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.112.125.32
※ 編輯: ararthur 來自: 140.112.125.32 (09/13 12:37)
1F：推 conective:control用vector only看看自接比例 09/13 13:43
請問這裡是說用切兩刀的vector 還是切一刀的?
切一刀的有做過 約500顆
2F：→ conective:長出來菌落太少 可以提高vector:inser到1:10 09/13 13:45
3F：→ conective:ligation時間可作一組16度c overnight看看 09/13 13:46
4F：→ conective:gel extraction完有再load一點去跑膠看看濃度嗎？ 09/13 13:47
5F：→ conective:你測DNA濃度的方式是什麼？有時濃度低估或高估會影響 09/13 13:47
6F：→ conective:通常都是因為高估造成實際上vector:insert比偏低 09/13 13:48
7F：→ conective:菌落就會長的少 所以這時候要確定濃度或者提高比例 09/13 13:48
8F：→ conective:insert越大 膠體純化回收後需求濃度越高 09/13 13:49
※ 編輯: ararthur 來自: 140.112.125.32 (09/13 14:48)
9F：推 conective:就是你VECTOR的部份 切兩刀的不要加insert 加一樣體積 09/13 19:55
10F：→ conective:的水 一樣作transformation 看會長幾顆 09/13 19:55
11F：推 Realthugz:你的control根本在搞笑... 09/14 19:34
12F：→ ararthur:是說丟太多嗎? 那時也沒有特別去dilute 就隨便取個.5ul@@ 09/15 00:11
13F：→ alicialai:這樣切不會把BamHI site切掉嗎在第二次切的時候? 09/15 06:42
14F：→ ararthur:我以為應該是留下---/ +-----/ +-[ gene ]-+-----/ +--- 09/15 09:12
15F：→ ararthur: BamHI EcoRI 09/15 09:12
※ 編輯: ararthur 來自: 111.249.167.145 (09/15 09:13)