作者ararthur ()
看板Biotech
标题[求救] Ligation
时间Tue Sep 13 12:35:13 2011
Insert 大小为1.5k 已放入TA里
Vector pcDNA3.1(+) 大小为5.5k
比较麻烦的是 Insert和Vector可以用的cut site有点复杂
→
---+-----+-[ gene ]-+-----+--- Insert-pGEM-T easy
EcoRI
BamHI Hind3
EcoRI
→
------------+----+------------ Vector pcDNA3.1(+)
BamHI EcoRI
(G/GATCC)--17nt--(G/AATTC)
我以BamHI 和EcoRI作为连结处
Digestion protocol为
Insert(10ug~30ug) BamHI先切 1hr 再加入EcoRI 并补满buf 再切2hr
^此步有先取1ul出来跑胶 确定有切完
Vector(10ug~30ug) BamHI+EcoRI 同时切3hr
gel extraction >
ligation (molar ratio=1:1, 1:3, 3:1) RT 3hr >
transformation
positive control丢约200ng 长满长片
ligation p/c 用vector切一刀 丢40ng去ligation 约有500颗
但实验组永远都只有1~2颗的colonies
而且抽出来size都不正确
想请问这些实验步骤中有没有什麽问题?
会不会是Vector的两个cut size太近 时间太短?
还是可能是Ligation步骤问题?
谢谢各位:)
祝大家实验顺利
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.112.125.32
※ 编辑: ararthur 来自: 140.112.125.32 (09/13 12:37)
1F：推 conective:control用vector only看看自接比例 09/13 13:43
请问这里是说用切两刀的vector 还是切一刀的?
切一刀的有做过 约500颗
2F：→ conective:长出来菌落太少 可以提高vector:inser到1:10 09/13 13:45
3F：→ conective:ligation时间可作一组16度c overnight看看 09/13 13:46
4F：→ conective:gel extraction完有再load一点去跑胶看看浓度吗？ 09/13 13:47
5F：→ conective:你测DNA浓度的方式是什麽？有时浓度低估或高估会影响 09/13 13:47
6F：→ conective:通常都是因为高估造成实际上vector:insert比偏低 09/13 13:48
7F：→ conective:菌落就会长的少 所以这时候要确定浓度或者提高比例 09/13 13:48
8F：→ conective:insert越大 胶体纯化回收後需求浓度越高 09/13 13:49
※ 编辑: ararthur 来自: 140.112.125.32 (09/13 14:48)
9F：推 conective:就是你VECTOR的部份 切两刀的不要加insert 加一样体积 09/13 19:55
10F：→ conective:的水 一样作transformation 看会长几颗 09/13 19:55
11F：推 Realthugz:你的control根本在搞笑... 09/14 19:34
12F：→ ararthur:是说丢太多吗? 那时也没有特别去dilute 就随便取个.5ul@@ 09/15 00:11
13F：→ alicialai:这样切不会把BamHI site切掉吗在第二次切的时候? 09/15 06:42
14F：→ ararthur:我以为应该是留下---/ +-----/ +-[ gene ]-+-----/ +--- 09/15 09:12
15F：→ ararthur: BamHI EcoRI 09/15 09:12
※ 编辑: ararthur 来自: 111.249.167.145 (09/15 09:13)