作者wintercoldb (balance)
看板Biotech
標題[求救] Realtime PCR
時間Wed Sep 7 15:41:52 2011
新手第一次發問
最近在做一批microRNA的實驗
先從血清將microRNA用trizol LS抽出後
用nanodrop測出OD值 稀釋到固定濃度後
轉RT
轉完RT後用ABI stepone plus realtimePCR做相對定量
每個sample都有做 三重複
問題來了
同樣的檢體 分開轉RT後再定量CT值都差了3-4左右
請問是什麼原因造成呢???
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.112.125.33
1F：推 DJHINN:為什麼同樣的檢體要分開RT = =? 09/07 15:45
2F：→ DJHINN:而不是RT完後再分裝? 09/07 15:46
3F：→ DJHINN:有沒有先測檢體的RNA濃度? 09/07 15:47
4F：→ wintercoldb:因為第一次測RT的NC汙染 所以重轉重定量 09/07 16:56
5F：→ wintercoldb:有用nanodrop測RNA OD值 09/07 16:56
6F：→ wintercoldb:兩次結果不同 就一直被老闆問為什麼會不同 = = 09/07 16:57
7F：→ wintercoldb:除了因為污染還有可能是什麼原因呢? 轉RT的效能也不同 09/07 16:57
8F：→ wintercoldb:?? 09/07 16:58
9F：推 ararthur:去看一下abi software裡Ct值的threshold line是否合理 09/08 10:53
10F：→ ararthur:有時step1+ 會沒設定好threshold要改成manual去調整 09/08 10:53
11F：→ ararthur:另外RT的牌子是? 可以試看看invitrogen和qiagen的 這兩組 09/08 10:54
12F：→ ararthur:我做出來同一組sample都穩定許多 有用過便宜牌子結果三重 09/08 10:54
13F：→ ararthur:覆Ct值也是差很多 兩個點可以去看看 09/08 10:55
14F：→ wintercoldb:感謝以上回答 會再去研究看看thx 09/08 11:32
15F：推 DJHINN:差...3~4個 Ct 我覺得蠻誇張的...雖然 RT 可能效能有差.. 09/09 01:09
16F：→ johanjohan:microRNA? 09/10 00:24