作者candyjell (我懷念我的吉他.........)
看板Biotech
標題[求救] genomic DNA做PCR 以及 virus DNA做southern
時間Sun Sep 4 13:50:53 2011
大家好,我有兩個問題想請問各位前輩
第一個問題:
請問我們實驗室有一組GAPDH的primer
Forward:5-tgcaccaccaactgcttagc-3
Reverse:5-gatgtcatcatatttggcagg-3
我推算cDNA PCR夾出的size是321bp (參考序列 NM_002046.3)
夾出的序列如下(數字為nt位置)
556 tgcac caccaactgc ttagcacccc tggccaaggt catccatgac
aactttggta tcgtggaagg actcatgacc acagtccatg ccatcactgc cacccagaag
actgtggatg gcccctccgg gaaactgtgg cgtgatggcc gcggggctct ccagaacatc
atccctgcct ctactggcgc tgccaaggct gtgggcaagg tcatccctga gctgaacggg
aagctcactg gcatggcctt ccgtgtcccc actgccaacg tgtcagtggt ggacctgacc
tgccgtctag aaaaacctgc caaatatgat gacatc 876
genomic DNA 做PCR夾出的size是514bp (參考序列 NG_007073.2)
夾出的序列如下(反白部分為intron)
7829tg caccaccaac tgcttagcac ccctggccaa ggtcatccat gacaactttg gtatcgtgga
aggactcatg
gtatgagagc tggggaatgg gactgaggct cccacctttc tcatccaaga ctggctcctc
cctgccgggg ctgcgtgcaa ccctggggtt gggggttctg gggactggct ttcccataat ttcctttcaa
ggtggggagg gaggtagagg ggtgatgtgg ggagtacgct gcagggcctc actccttttg cagaccacag
tccatgccat cactgccacc cagaagactg tggatggccc ctccgggaaa ctgtggcgtg atggccgcgg
ggctctccag aacatcatcc ctgcctctac tggcgctgcc aaggctgtgg gcaaggtcat ccctgagctg
aacgggaagc tcactggcat ggccttccgt gtccccactg ccaacgtgtc agtggtggac ctgacctgcc
gtctagaaaa acctgccaaa tatgatgaca tc8342
但是我拿genomic DNA當template 夾出的size卻是3百多一點
5百多和8百多各有一條微弱的band
請問為什麼並非所推想的可夾出5百多的band?
請問該怎麼改善?
第二個問題:
請問我將病毒感染細胞後,再從細胞中將病毒DNA萃取出來
(同時也會萃取到細胞的genomic DNA)
之後要跑southern blot來比較不同實驗組的病毒DNA replication
請問我要如何決定每個實驗組要load多少量DNA,
才能比較出不同實驗組的病毒DNA replication有無不同,而並非是人為誤差所造成?
是否也有一些internal control或其他更好的方法?
謝謝大家幫忙!
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◆ From: 114.40.250.246
1F：推 tinapig:1.PCR條件? 2.可以先查你做的病毒類似實驗的期刊實驗方法 09/04 20:04
2F：→ tinapig:因為不同病毒感染細胞的複製狀況會有不同 09/04 20:04
4F：→ qiet:你的primer去做primer blast出來結果看起來就會夾到一堆3xx 09/04 21:25
5F：→ qiet:的片段 建議換一對吧 09/04 21:26
6F：→ candyjell:看起來是夾到一堆non-specific.我換primer了.希望能做 09/06 22:14
7F：→ candyjell:出來.謝謝你們的幫忙 09/06 22:14