大家好,我有两个问题想请问各位前辈 第一个问题: 请问我们实验室有一组GAPDH的primer Forward:5-tgcaccaccaactgcttagc-3 Reverse:5-gatgtcatcatatttggcagg-3 我推算cDNA PCR夹出的size是321bp (参考序列 NM_002046.3) 夹出的序列如下(数字为nt位置) 556 tgcac caccaactgc ttagcacccc tggccaaggt catccatgac aactttggta tcgtggaagg actcatgacc acagtccatg ccatcactgc cacccagaag actgtggatg gcccctccgg gaaactgtgg cgtgatggcc gcggggctct ccagaacatc atccctgcct ctactggcgc tgccaaggct gtgggcaagg tcatccctga gctgaacggg aagctcactg gcatggcctt ccgtgtcccc actgccaacg tgtcagtggt ggacctgacc tgccgtctag aaaaacctgc caaatatgat gacatc 876 genomic DNA 做PCR夹出的size是514bp (参考序列 NG_007073.2) 夹出的序列如下(反白部分为intron) 7829tg caccaccaac tgcttagcac ccctggccaa ggtcatccat gacaactttg gtatcgtgga aggactcatg gtatgagagc tggggaatgg gactgaggct cccacctttc tcatccaaga ctggctcctc cctgccgggg ctgcgtgcaa ccctggggtt gggggttctg gggactggct ttcccataat ttcctttcaa ggtggggagg gaggtagagg ggtgatgtgg ggagtacgct gcagggcctc actccttttg cagaccacag tccatgccat cactgccacc cagaagactg tggatggccc ctccgggaaa ctgtggcgtg atggccgcgg ggctctccag aacatcatcc ctgcctctac tggcgctgcc aaggctgtgg gcaaggtcat ccctgagctg aacgggaagc tcactggcat ggccttccgt gtccccactg ccaacgtgtc agtggtggac ctgacctgcc gtctagaaaa acctgccaaa tatgatgaca tc8342 但是我拿genomic DNA当template 夹出的size却是3百多一点 5百多和8百多各有一条微弱的band 请问为什麽并非所推想的可夹出5百多的band? 请问该怎麽改善? 第二个问题: 请问我将病毒感染细胞後,再从细胞中将病毒DNA萃取出来 (同时也会萃取到细胞的genomic DNA) 之後要跑southern blot来比较不同实验组的病毒DNA replication 请问我要如何决定每个实验组要load多少量DNA, 才能比较出不同实验组的病毒DNA replication有无不同,而并非是人为误差所造成? 是否也有一些internal control或其他更好的方法? 谢谢大家帮忙! --

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