作者cmublue (BLUE)
看板Biotech
標題[求救] real-time PCR 試劑問題
時間Sat Sep 3 13:37:59 2011
小弟實驗室的real-time PCR機器是用ABI step one plus
之前是使用Roch的reagnt
最近剛換了一家新廠牌的SYBR green reagent
(KAPA SYBR FAST qPCR kit, Master Mix 2X ABI Prism)
發現在melt curve中會出現 double peak
起初以為是primer 汙染 , 但是在做檢測時發現(primer重泡)
就算是negative control (只load 水)
不只有melt curve 還會有一般的螢光訊號 (28-30的cycle附近)
要說這是汙染 為免汙的量也太大了吧
目前是還沒去將p出來的產物拿去跑膠
想請問各位先進, 除了primer汙染之外,還有什麼其他的因素會有可能造成這個現象
ps我記得業務有說過他們家的這個reagent SYBR green下很重 ,所以訊號都會很強
但跟我這個結果有關係嗎= =
以上 感謝各位幫忙解惑 ^ ^/
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◆ From: 140.128.67.246
1F：推 Rarelay:我只加 template or 只加 primer set 都沒有訊號 09/03 14:59
2F：→ Rarelay:忘了說我是用 KAPA Universal Reagent 09/03 23:04
3F：→ nexusfantasy:你的 negative control 是指沒有 template 嗎？ 09/03 23:47
4F：→ nexusfantasy:還是全部都是水 給機器去讀？ 09/03 23:48
5F：→ nexusfantasy:要先排除掉是primer dimer的可能性 才考慮background 09/03 23:51
6F：→ nexusfantasy:KAPA我之前用在bio-rad的機器 效果還ok 沒什麼問題 09/03 23:52
7F：→ cmublue:N大,yes只load水和primer with reagent (no template) 09/04 02:52
8F：→ nexusfantasy:你的internal control是否也有兩個波峰？ 09/04 13:10
9F：→ nexusfantasy:若沒有 可能是target gene引子設計或黏合溫度的問題 09/04 13:11
10F：→ TauriCrab:就污染 不用太相信廠商 09/09 16:57