作者Killuo ( )
看板Biotech
標題[求救] 單一PCR產物進行雙向定序,卻出現多重序列的結果
時間Tue Aug 30 22:46:40 2011
我遇到的問題是這樣的:
已經確認PCR產物只有一條,沒有雜band,長度700bp,此產物內並無重複序列
從F端進行定序,大約定到400bp以後開始出現多重序列
從R端進行定序,大約定到500bp以後開始出現多重序列
而且重複實驗以後所得的定序結果都一樣,
連多重序列開始發生的位點,甚至連訊號都一樣
(例如此一位點是AC的多重序列,且A的強度大於C的強度,三次的定序結果都一樣)
簡單示意圖如下:
X是合併F和R端定序結果後,所得到的完整PCR產物序列
F是F端定序的結果,是很清楚的單一序列
R是R端定序的結果,是很清楚的單一序列
-表示定序結果出現多重序列的位點
FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFF----------------------
5' XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX 3'
------------------RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
想問一下是什麼樣的原因導致單一PCR產物的後半段出現多重序列?
有沒有辦法可以解決這個問題,好讓後半段的定序結果變好呢?
先謝謝各位版友的熱心解答
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 61.31.168.219
1F：推 captdavince:original template is? 08/31 01:00
2F：→ Killuo:野生種杜鵑花的whole genome DNA (以CTAB法萃取) 08/31 09:38
3F：推 Timepasser:要不要試試看送plasmid定序? 08/31 20:45
4F：→ Killuo:所以PCR沒辦法解決這個問題,只能靠cloning了嗎@@? 09/01 00:24
5F：推 Timepasser:重新看了一下，我想應該不是妳的問題，而是後面的訊號 09/01 20:08
6F：→ Timepasser:變弱了，所以才會有妳所謂的"多重序列"出現。 09/01 20:09
7F：→ Timepasser:要不要跟定序公司討論看看？只能讀到500bp實在有點少 09/01 20:10
8F：推 cint:我的習慣會是兩端各抓350bp然後接起來 定序後半都不是很可信 09/02 23:12
9F：推 zoom8080:有可能是hetero的shift 08/09 14:59