作者Killuo ( )
看板Biotech
标题[求救] 单一PCR产物进行双向定序,却出现多重序列的结果
时间Tue Aug 30 22:46:40 2011
我遇到的问题是这样的:
已经确认PCR产物只有一条,没有杂band,长度700bp,此产物内并无重复序列
从F端进行定序,大约定到400bp以後开始出现多重序列
从R端进行定序,大约定到500bp以後开始出现多重序列
而且重复实验以後所得的定序结果都一样,
连多重序列开始发生的位点,甚至连讯号都一样
(例如此一位点是AC的多重序列,且A的强度大於C的强度,三次的定序结果都一样)
简单示意图如下:
X是合并F和R端定序结果後,所得到的完整PCR产物序列
F是F端定序的结果,是很清楚的单一序列
R是R端定序的结果,是很清楚的单一序列
-表示定序结果出现多重序列的位点
FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFF----------------------
5' XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX 3'
------------------RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
想问一下是什麽样的原因导致单一PCR产物的後半段出现多重序列?
有没有办法可以解决这个问题,好让後半段的定序结果变好呢?
先谢谢各位版友的热心解答
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 61.31.168.219
1F：推 captdavince:original template is? 08/31 01:00
2F：→ Killuo:野生种杜鹃花的whole genome DNA (以CTAB法萃取) 08/31 09:38
3F：推 Timepasser:要不要试试看送plasmid定序? 08/31 20:45
4F：→ Killuo:所以PCR没办法解决这个问题,只能靠cloning了吗@@? 09/01 00:24
5F：推 Timepasser:重新看了一下，我想应该不是你的问题，而是後面的讯号 09/01 20:08
6F：→ Timepasser:变弱了，所以才会有你所谓的"多重序列"出现。 09/01 20:09
7F：→ Timepasser:要不要跟定序公司讨论看看？只能读到500bp实在有点少 09/01 20:10
8F：推 cint:我的习惯会是两端各抓350bp然後接起来 定序後半都不是很可信 09/02 23:12
9F：推 zoom8080:有可能是hetero的shift 08/09 14:59