作者jeffdon2 (kkk)
看板Biotech
標題[求救] 人類紅血球的螢光染色
時間Mon Aug 29 15:10:13 2011
想要請教各位生醫底子比在下強n倍高手，關於紅血球的螢光染色用nile red是否恰當
小弟的染色步驟是先取3ul的血球溶到等滲透壓的蔗糖水溶液內加以輕微晃動分散，
接著將nile red染劑2ul加入，一樣輕微晃動5分鐘使其均勻混和，最後以離心置換蔗糖
水溶液的方式將多餘的染劑去除掉(清洗兩次)，再加入調整過導電度的等滲透壓buffer
可是問題來了，經過離心清洗過後紅血球變得相當難分散，在顯微鏡底下確認過都聚集
成一團一團的狀況，想請教的問題是有可能是nile red的影響導致抗凝血劑失效嗎，又
或是說抗凝血劑本身有問題?
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 111.242.179.28
1F：推 leoblack:清洗過程是不是會把抗凝血劑沖淡?!蔗糖水是否要抗凝血劑? 08/29 18:02
2F：→ jeffdon2:多謝l大的提醒，只是抗凝血劑有在單賣嗎? 08/29 18:45
3F：→ jeffdon2:當初是買整組的抗凝血玻璃管，不清楚是否有單賣 08/29 18:46
4F：推 malakaki:Buffer配方提供一下~ 08/29 22:37
5F：推 weisheng0518:是用 EDTA tube (紫頭管)嗎? 08/30 02:12
6F：→ weisheng0518:PBS 洗三次, EDTA 洗掉, 凝血因子也洗掉了 08/30 02:13
7F：→ weisheng0518:還會 agglutination 大概是沒洗乾淨 08/30 02:14
8F：→ weisheng0518:還有, 高濃度的 sucrose 會抑制 agglutination 08/30 02:15
9F：推 weisheng0518:FYI, 洗乾淨的 RBC, 室溫一個禮拜都不會 08/30 02:18
10F：→ weisheng0518:agglutination. (沒乾掉的話) 08/30 02:19
11F：→ jeffdon2:weisheng0518大，是用EDTA tube (紫頭管)沒錯 08/30 11:00
12F：→ jeffdon2:buffer的話是sucrose300mM+PBS去調整導電度 08/30 11:01
13F：推 weisheng0518:如果PBS洗完還是一堆 agglutination, 08/30 11:04
14F：→ weisheng0518:我猜是採血完沒跟 EDTA mix 均勻. 08/30 11:05
15F：→ jeffdon2:所以weisheng0518大的意思是抗凝血玻璃管有問題嗎? 08/30 11:07
16F：→ weisheng0518:300 mM sucrose 很高. 有non-specific inhibition 08/30 11:07
17F：→ weisheng0518:是用過期的紫頭管嗎?? @@a 08/30 11:08
18F：→ jeffdon2:學長是有覺得這次買得管子裡抗凝血劑有點少，而且還有凝 08/30 11:11
19F：→ jeffdon2:結在管壁的現象 08/30 11:11
20F：→ jeffdon2:尚未染色前有用顯微鏡確認過，分散的的確不如以往 08/30 11:12
21F：推 weisheng0518:那再重抽血, 確定馬上抽完馬上mix均勻 08/30 11:13
22F：→ jeffdon2:染色之後更糟 08/30 11:13
23F：→ jeffdon2:ok，謝謝weisheng0518大的回答，只好重抽血了 08/30 11:16
24F：推 weisheng0518:Good luck :) 08/30 11:18
25F：推 weisheng0518:BTW, 覺得 EDTA 比較少, 那就不要抽一整管血 08/30 11:21
26F：→ weisheng0518:2/3 管滿或更少 08/30 11:22