作者Blibra1002 (man)
看板Biotech
標題Re: [求救] 大鼠噬骨細胞Osteoclast primary culture
時間Wed Aug 24 20:50:49 2011
※ 引述《hchung (hiflypig)》之銘言：
: 之前只有養過會貼附的細胞，這次比較大的挑戰是大鼠噬骨細胞的培養，
: 參考之前paper的作法，不過paper上寫的是小鼠的作法，
: 想說應該差不多，所以就照著方法作。
: 1.將大鼠腿骨取下，過酒精(15秒)，放進medium
: 2.用骨剪將腿骨兩端剪開，插入針頭用medium將細胞沖出。
: 3.用pipette 將細胞盡量沖散
: 4.離心3240rpm, 5min
: 5.吸去上清液後用medium懸浮。
: 6.利用ficoll去除紅血球，取中層單核細胞的部分。
: 7.將細胞養在flask，含25ng M-CSF
: 8.O/N 取懸浮細胞作培養，加入50ng的RANKL。
: 可是問題來了，我的細胞過了一個禮拜完全沒有形成大顆的噬骨細胞，
: 後來將細胞取出來用trypan blue看細胞到底是死的還是活的，發現細胞都是死掉的細胞。
: 之後又試了一次，將上面細胞液先抽出(我覺得上面很飄的應該是死細胞)
: 再加入新的medium，在shaker上37C 搖了3個小時。
: 結果還是沒細胞(冏)。
: 想問板上有沒有噬骨細胞培養高手可以解惑呢？
: 另外我想問dentin slice哪裡有賣，還是都是自己作比較多啊~~~
: 以上，拜託大家了!!
你好，我做過這實驗，但是方法不太相同
1.取腿骨，不過酒精直接放到0% DMEM medium中
2.相同2
3.相同3
4.離心1500rpm，不知道你是否roter大小不同所以離3240?
我是大顆落地式的roter
5.吸上清
6.沒做這步，紅血球過幾天就會死掉了
7.放到10cm dish沒加MCSF
8.相同8
另外我們會取一隻老鼠的後兩隻腿骨，以及前上臂骨
種成一盤10cm，因為細胞數太少會分化不出來
如果沒有去紅血球，我們種到24well中是10^6顆
最後我沒有買dentin slice
我買Corning® Osteo Assay Surface
很便宜的，試試看
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◆ From: 140.128.67.245
1F：推 hchung:太感謝你了~~不過我可以再問你一個問題嗎? 08/24 21:32
2F：→ hchung:就是...這樣的做法大概多久可以看到大顆的細胞呢? 08/24 21:33
3F：→ Blibra1002:印象中是一個禮拜左右.... 09/07 11:46
4F：推 hchung:感謝您^^ 09/12 17:29