作者rickkao11 (rickkao11)
看板Biotech
標題[求救] Luciferase assay
時間Tue Aug 23 23:14:03 2011
使用的是promega的kit
每次加入40ul的substract 和 20ul的sample
在黑色九十六孔盤中讀一秒
可是幾次實驗做下來
每次的結果都不太一樣
有時候多有時候少
在螢光顯微鏡下看trasfection的效率都差不多(用GFP)
請問大家在做luciferase assay時有沒有什麼需要注意的地方
可以降低差異的發生
謝謝!!!
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.112.211.200
1F：推 iceking:試試Dual luciferase assay , 效率用看的不準~ 08/23 23:20
謝謝，實驗室有試用過這個Kit，可是我們加的東西似乎會影響到另外的那個plasmid
表現，用那個normalize之後數劇就平掉了，所以後來就沒用dual了
後來都只能大約用protein assay來normalized
※ 編輯: rickkao11 來自: 140.112.211.200 (08/23 23:40)
2F：推 chxx:應該用白色的阿 黑色會吸光 08/24 02:42
3F：推 HEK293:用黑盤背景會低一點，只用protein定量有盲點 08/24 09:03
4F：→ HEK293:可以的話還是用renilla比較好，平掉就是沒趨勢阿= = 08/24 09:04
5F：→ HEK293:順便補充，是substrate 08/24 09:04
6F：推 iceking:差異的話，關鍵應該是在cell culture的部分 08/24 10:10
7F：推 Realthugz:每次細胞數有差不多嗎 或生長情況差不多 08/24 11:32
8F：→ Realthugz:我是會co-transfect beta-gal做normalization 08/24 11:33
9F：推 iceking:細胞的變數相當的多,光是有沒有均勻的seed就是一門學問 08/24 23:17
10F：→ iceking:然後seed細胞後,隔多久時間開始做transfection,這也重要. 08/24 23:18
11F：→ iceking:如果要overnight,細胞就開始繁殖,細胞數可能就會不一樣多 08/24 23:18
12F：→ iceking:所以有沒有需要做serum starvation也要評估. 08/24 23:19
13F：→ iceking:雖然現在的kit大多都說serum不會影響transfection,但依照 08/24 23:20
14F：→ iceking:經驗,serum free的transfection效果還是比較好,當然,有 08/24 23:20
15F：→ iceking:commercial的OPTI-MEM的話就用. 08/24 23:21
16F：→ iceking:然後,也是最重要的一點,就是Luciferase不建議和螢光一起 08/24 23:23
17F：→ iceking:送進細胞,我以前曾經這樣做過,但在測量冷光及螢光數值時 08/24 23:24
18F：→ iceking:非常困擾,我還要把well中的細胞平均分到白盤&黑盤當中 08/24 23:25
19F：→ iceking:測出來變異相當的大. 後來我就改用dual assay了! 08/24 23:26
20F：推 iceking:dual的plasmid比例很重要,千萬別一味的1:1送進細胞,多try 08/24 23:28
21F：→ iceking:幾種不同condition 或許plasmid就表現了~ 08/24 23:29
22F：→ rickkao11:謝謝樓上!!! 08/25 17:57